PCR相关技术在植物病毒检测中的应用

游雨欣

摘要：由植物病毒感染引起的作物歉收是农业生产中的持续问题。为了最大程度地减少病毒造成的破坏并确保农业的可持续发展，探索快速准确的检测方法来控制这些植物病毒非常重要。而PCR和建立在PCR基础上的分子生物学技术以其灵敏、快速、简便等优点在植物病害检测中得到了广泛应用[1]。本综述就此着重论述PCR相关技术的多种分子生物学技术的原理及其在植物病毒检测中的应用，并对未来研究植物病毒检测方面做出了展望。

关键词：PCR技术;植物病毒;检测

植物病毒已经发现了一百余年，但是仍然没有有效的方法来预防和治愈。中国有的植物病毒种类繁多，每年都会对作物的产量和质量产生重大影响。、因此，缺乏有效的控制剂会导致很高的经济损失，建立方便，高效和快速的植物病毒检测方法是解决问题的关键。

目前用于病毒检测法主要是酶联免疫吸附法（ELISA），尽管ELISA的检测灵敏度远高于传统生物学方法，但仍存在一些难以检测和含量少的韧皮部病毒的缺陷[2]。而PCR及其相关技术以其快速、灵敏和准确等优点已广泛应用于植物病毒的检测。本文评述了近年来RT-PCR技术在植物病毒检测中应用，及以其为基础衍生出来的一些分子生物技术，为进后续的研究提供参考价值。

1反转录聚合酶链式反应

RT-PCR已被遍及用于植物病毒疾病的检测中，通常包含四个步骤：从待测样品中提取病毒RNA，cDNA的逆转录合成，目标cDNA片段的PCR扩增以及PCR产物的电泳检测，添加病毒的特异性引物以完成病毒的检测[3]。叶明等[4]基于Taq聚合酶的聚合酶活性并具有逆转录酶活性的特征，发现仅在Taq聚合酶的作用下即可完成RT-PCR扩增。

现如今随着分子生物学技术的不断进步，传统的RT-PCR检测技术也在不断完善，主要集中在RT-PCR反应程序和反应体系、病毒RNA的提取、PCR产物的检测、特异性的提高等方面，也因此不断拓宽了一系列的新方法。

1.1多重RT-PCR检测技术

多重RT-PCR（m-RT-PCR）对常规RT-PCR反应体系进行改进，在同一RT-PCR反应体系中使用多对分别针对不同病毒的引物，在一个PCR反应中同时扩增多种病毒的基因片段，它可以同时检测多种病毒，提高了检测效率。m-RT-PCR也可对同一种病毒进行多重检测，降低假阳性的出现。

张威等[5]基于马铃薯生产领域中发病率高、易发生复合感染的PV、PVY和PLRV病毒，建立了m-RT-PCR检测体系。DNAstar软件测序结果显示，PLRV、PVY、PVS扩增产物片段大小与预期一致，序列与相应病毒序列同源性达98%以上，验证了m-RT-PCR检测结果的可靠性。因此，RT-PCR检测技术真正投入实际应用的发展方向将是m-RT-PCR技术。

1.2免疫捕捉RT-PCR检测技术

免疫捕捉RT-PCR（IC-RT-PCR）是结合免疫学和RT-PCR建立的检测方法。IC-RT-PCR操作过程：用特异性抗体捕获病毒颗粒后，进行热变性，然后进行RT-PCR扩增和电泳检测。陈建军[6]等使用IC-RT-PCR检测-Ⅲ葡萄叶卷曲病毒，建立IC的检测方法，RT-PCR方法极大拓宽了病毒检测领域，弥补了ELISA和RT-PCR以及这两种方法的一些不足，是一种较可行的病毒检测方法。

1.3试管捕捉-RT-PCR检测技术

TC-RT-PCR是在普通RT-PCR的基础上发展起来的一种新方法。它不需要提取RNA，但使用了一个病毒检测和基因克隆技术，它结合了非特异性结合的病毒粒子与试管和RT-PCR扩增外壳蛋白，以避免RNA降解与普通RT-PCR可以获得相同的结果，该技术已被应用于一些植物病毒的检测。

沈建国等[7]建立了大豆种皮上BPMV的TC-RT-PCR检测方法，既不需要特异性抗血清，也不需要提取高纯度的RNA，并且避免了使用有机溶剂，并且操作简便，因此具有良好的应用价值，不仅适合于少量大豆种子直接检测BPMV，还可以用于ELISA试验阳性，用于大豆種子实验。

1.4核酸序列依赖性扩增检测技术

NASBA最先由Guatellietal.等[8]提出，接着Compton[9]对此进行了完善，并且更进一步来系统说明。NASBA是一种基于PCR的恒温扩增技术，适用于单链RNA的一步扩增和检测。与PCR原理不同，NASBA由一对引物引导。在含有T7RNA聚合酶，RNAseH，逆转录酶AMV和NTP的反应系统中，核苷酸序列的等温扩增是通过连续且均匀的体外特异性酶促反应进行的。NASBA的应用十分广泛，常用于检测带有豆类病毒的草莓干痘病毒，南芥菜花叶病毒，柑桔裂皮，柑桔病毒IV，马铃薯叶片卷曲病毒等。

1.5 环介导等温技术

LAMP是一种特异性，灵敏和简单的新型核酸扩增技术，该技术是利用BstDNA聚合酶链置换活性提供反应动力学，在恒温短时（30～60 min）的条件下完成目标DNA的有效扩增，反应分为两个阶段，即反应物哑铃模板合成，循环开始时的基因扩增，延伸和循环阶段[10]。

Fukuta等[11]开发了一种基于CaMV35S启动子的LAMP检测方法，可以检测出0.5%?5%的转基因大豆及其制品。孙敏[12]等使用LAMP方法检测花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子，其灵敏度高达0.002%。

2展望

农药的过度使用，环境变化和全球化加剧植物病毒的传播和发展，使植物病毒的检测变得更加重要。生物检测简单明了，但由病毒-宿主相互作用引起症状常常被混淆，因此开发出基于分子生物学的植物病毒血清学检测方法，并已被广泛使用，其中包括LAMP等温核酸扩增方法，包括比常规PCR更高的PCR方法，并且作为检测植物病毒敏感性更高的一部分。并且正在被应用。

随着生物学的发展，植物病毒的检测技术也在不断发展，例如，研究了基于微流控芯片技术和microRNA深度测序技术的检测方法或将其应用于植物病毒的检测。研究了使用磁珠和横流纸传感器進行传统免疫测定和色谱分析的反应（RPCR），它们克服了单一方法的缺点，使检测更加高效和灵敏。为避免单一技术的缺陷，检测结合两种以上技术的方法越来越受到人们的重视，有望成为未来植物病毒检测技术的主要研究方向，并成为一种强大的病毒识别工具。

References

[1]. 卢会翔等， 甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国农业科学， 2016. 49（01）： 90-102.

[2]. 吴兴泉等， 马铃薯病毒的RT-PCR检测技术评述. 中国马铃薯[J]， 2011. 25（04）： 251-254.

[3]. 秦文韬等， 环介导恒温扩增技术（LAMP）及其在植物病毒检测中的研究进展. 中国农学通报[J]， 2013. 29（21）： 170-174.

[4]. 叶明等， 单酶法RTP-CR检测马铃薯纺锤块茎类病毒. 华北农学报[J]， 2002（01）： 41-45.

[5]. 张威等， 三种马铃薯病毒多重RT-PCR检测体系建立. 东北农业大学学报[J]， 2014. 45（05）： 13-18.

[6]. 陈建军等， IC-RT-PCR检测葡萄卷叶病毒Ⅲ的研究. 河南农业科学[J]， 2006（08）： 109-112.

[7]. 沈建国等， TC/IC-RT-PCR检测黄瓜绿斑驳花叶病毒. 福建农林大学学报（自然科学版）[J]， 2012. 41（01）： 13-17.

[8]. Guatelli， J.C.， et al.， Isothermal， in vitro amplification of nucleic acids by a multienzyme reaction modeled after retroviral replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 1990. 87（19）： p. 7797-7797.

[9]. Compton， J.， Nucleic acid sequence-based amplification[J]. Nature， 1991. 350（6313）： p. 91-200.

[10]. Notomi， T.， et al.， Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J]. Nucleic acids research， 2000. 28（12）： p. E63-E63.

[11]. Fukuta， S.， et al.， Detection of Ceratocystis Fimbriata from Fig Tree and Soil by the Loop-mediated Isothermal Amplification （LAMP） Method[J]. Research Bulletin of the Aichi-ken Agricultural Research Center， 2009（41）： p. 1-6.

[12]. 孙敏等， 花椰菜花叶病毒CaMV 35S启动子LAMP检测方法的建立[J]. 食品科技， 2010. 35（04）： 255-258.