肺癌癌组织中过氧化物酶增殖体激活受体γ基因表达水平对培美曲塞化疗疗效的预测价值*

杨 昕，刘 芳，杜 静，张继朋

1.陕西中医药大学第二附属医院病理科(咸阳 712000)；2.空军军医大学唐都医院胸外科(西安 710038)

随着空气污染问题的不断恶化，肺癌作为目前发病率及病死率最高的恶性肿瘤，其发病率及病死率依然不断上升[1]，非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌最常见的类型，还可以进一步分为腺癌、鳞癌及大细胞癌[2]，早期NSCLC选择手术治疗可以极大的提高生存时间，但超过75%的患者确诊时已是中晚期，错过了最佳治疗时机，这也是目前NSCLC 5年生存率不超过20%的重要原因[3]。培美曲塞是经美国食品和药物管理局批准用于治疗NSCLC的抗叶酸代谢抗肿瘤药物，对于NSCLC有着很好的疗效且毒性较低，对其他肿瘤也有不错的疗效[4]。过氧化物酶增殖体激活受体(Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs)是由配体激活的一类重要转录因子，有3种亚型，其中PPARγ位于多种信号途径转导的交叉点位置，在机体的多种生理及病理过程中都发挥着重要的调控作用[5]，并且有报道其与肿瘤进程的关系密切[6]。目前PPARγ表达水平与培美曲塞治疗NSCLC疗效之间关系报道较少，本次研究利用qRT-PCR检测了化疗前PPARγ的表达水平，并分析了PPARγ表达水平与培美曲塞化疗疗效及远期预后之间的关系。

资料与方法

1 一般资料 选取我院2014年1月至2017年1月诊治的经组织病理学验证为晚期NSCLC患者80例为研究对象。病例纳入标准：①经组织病理学或细胞学诊断为NSCLC，且影像学资料提供可测病灶，根据国际肺癌研究协会TNM分期[7]证实为Ⅲ期及Ⅳ期；②首次化疗，未进行过手术、放疗及分子靶向治疗；③适合且能够耐受培美曲塞联合顺铂治疗；④化疗期间为同步或序贯接受放疗及其他抗肿瘤治疗。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②预计生存期<3个月；③严重心、肝、肾功能不全者；④合并血常规及心电图结果异常；⑤无法配合完成治疗及复查者。80例入组患者中男44例，女36例，年龄40～72岁，中位年龄57岁，TNM分级Ⅲ b期21例，Ⅳ期59例。

2 研究方法

2.1 化疗方法：所有患者的治疗用量均根据体表面积计算。首日给予培美曲塞500 mg/m2，顺铂75 mg/m2，静脉滴注。并于化疗前1周开始口服叶酸400 μg/d，持续时间超过5 d，一直持续到末次给予培美曲塞后21 d，化疗前1 d至给药后1 d，3 d连续给予地塞米松4 mg口服，2次/d，并在化疗前1周于肌肉主色维生素B121000 μg，每3周期重复一次。每化疗2个周期评价一次。

2.2 PPARγ表达检测方法：按照试剂盒中说明书操作步骤提取瘤组织及对应正常组织的总RNA，提取后用紫外分光光度计检验，OD值(A260/A280)=1.8～2.1，并用凝胶电泳检测RNA的完整性；按照试剂盒种说明书进行cDNA的合成。反转录体系(10 μl)：2×miRNA反应混合液5 μl，0.1% BSA 1 μl，miRNA PrimeScript RT酶混合物1 μl，总RNA0.5 μl，去RNA酶ddH2O 2.5 μl。反应条件设置：37℃ 60 min，85℃ 5 s，4℃ 30 min。PCR体系10 μl：SYBR Prmix Ex Tap II(2×)5 μl，上游引物0.4 μl，下游引物0.4 μl，ROX Reference Dye II(50×)0.2 μl，cDNA 1 μl，ddH2O 3 μl。详细操作见试剂盒说明书。PCR反应参数设置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。内参基因采用β-actin，PPARγ扩增引物：上游引物5’-TGGAATTAGATGACAGCGACTTGG-3’，下游引物5’-AGGACTCAGGGTGGTTCAGC-3’。每个样孔设置3个复孔，取平均Ct值进行分析，以2-△△Ct作为相对表达量。

3 化疗效果评价标准 每化疗2个周期进行1次影像学复查，疗效评价参照RECIST标准判定。完全缓解：影像学可见肿瘤完全消失；部分缓解：可测量病灶体积缩小超过30%；稳定：介于部分缓解和进展之间；进展：可测量病灶体积增大超过20%或有新的病灶出现。客观有效率(ORR)=完全缓解率+部分缓解率，疾病控制率(DCR)=完全缓解率+部分缓解率+稳定率。

4 随 访 患者自病理确诊之日起开始门诊复查或电话随访，治疗后1年内每3个月门诊复查1次，2年内半年复查1次，以后至少每年复查一次，随访截止2019年1月，最少随访24个月，以患者死亡为研究重点。随访记生存时间及随访时状态(存活、死亡或其他)等。

结 果

1 化疗前癌组织中及癌旁组织中PPARγ表达水平 癌组织中PPARγ mRNA相对表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 化疗前肺癌组织中及癌旁组织中PPARγ表达水平

2 化疗疗效及病情控制与病情进展患者癌组织中PPARγ表达水平 根据治疗过程中影像学检查结果，完全缓解0例(0.00%)，部分缓解26例(32.50%)，稳定35例(43.75%)，进展19例(23.75%)，ORR为32.50%(26/80)，DCR为76.25%(61/80)；疾病控制组PPARγ mRNA表达水平高于病情进展组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 病情控制组和病情进展组中PPARγ表达水平

3 PPARγ表达水平对培美曲塞化疗疗效预测价值的ROC分析 ROC分析结果显示，PPARγ表达水平预测培美曲塞化疗有效的AUC=0.779，95%CI：0.673～0.885，Cutoff值为2.855(图1)。

图1 PPARγ表达水平对培美曲塞化疗疗效预测价值的ROC曲线

4 PPARγ表达水平与PFS间的关系 以ROC的cutoff值将所有患者分为PPARγ高表达组及PPARγ低表达组，PPARγ高表达组有51例，PPARγ低表达组有29例。80例NSCLC患者2年内死亡42例，存活率为47.50%，Kaplan-Meier曲线结果显示PPARγ高表达组的2年总生存率58.82%(30/51)显著高于PPARγ低表达组的27.59%(8/29)。见图2。

图2 PPARγ表达水平与2年生存率的关系

讨 论

培美曲塞作为一种抗叶酸代谢类抗肿瘤药物，能够抑制叶酸代谢过程中的3种关键酶活性，叶酸是人体必需的一类水溶性B族维生素，参与人体胸腺嘧啶及嘌呤的合成，培美曲塞主要就是通过抑制叶酸的合成，导致DNA和RNA的合成受阻，最终发挥抑制肿瘤细胞增殖的作用[8]。正是由于培美曲塞的多靶点性，其在临床抗肿瘤的运用上有不错的效果，尤其是对肺腺癌具有显著的抑制作用[9]，同时在用于非鳞NSCLC一线及二线治疗的效果也要优于多西他赛、吉西他滨等常用化疗药物[10]。本研究结果显示，对肺癌晚期患者进行培美曲塞联合顺铂化疗治疗发现，其ORR为32.50%，DCR为76.25%，表明培美曲塞联合顺铂化疗的效果良好，能够很好的控制住患者病情的进展。陈红等[11]研究发现培美曲塞联合顺铂治疗复发性肺腺癌患者的ORR为57.50%和87.50%，与本研究结果较为接近。

PPARγ是Ⅱ型核激素受体超家族中的一员，作为一种配体依赖性转录因子，在人体脂肪组织、乳腺、结肠、肺、卵巢、胎盘等中高表达，其在促进脂肪细胞的分化过程中发挥着重要的作用[12]。正是由于PPARγ的促分化效应，故而其被激活后还有抗细胞增殖功能，目前人体内发现的PPARγ配体主要是前列腺素，大量研究[13]表明，PPARγ配体可以通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭等过程来调控肿瘤的进程。本研究结果显示，PPARγ在肺癌组织中的相对表达量显著高于癌旁正常组织，这与李虹等[14]研究相一致，同时我们还发现，化疗前PPARγ水平越低，其化疗效果可能越差。可能是因为PPARγ具有调控癌细胞培美曲塞敏感性作用，高表达的PPARγ增加了肺癌细胞的培美曲塞敏感性，因此表达量越高培美曲塞化疗效果越好。李强等[15]研究发现，胃癌中PPARγ的mRNA表达量显著高于正常组织，同时高表达PPARγ患者的预后要优于表达患者，与本研究结果相符。

我们利用ROC曲线评估了PPARγ表达水平对培美曲塞化疗疗效预测价值，发现PPARγ表达水平预测培美曲塞化疗疗效的AUC达到了0.779，表明PPARγ表达水平具有不错的预测培美曲塞化疗疗效的效果价值。根据Cutoff值将患者分为PPARγ高表达组和PPARγ低表达组，进行Kaplan-Meier生存曲线分析显示，PPARγ高表达组的2年内无病生存率高于PPARγ低表达组，提示PPARγ表达水平还具有远期预后的预测价值。

综上所述，由于肺癌患者多半发现已是晚期，故而治疗多以延长患者的生存期及生活质量为主，在化疗的过程中对其疗效预测及及时的区分化疗不敏感患者具有重要的临床意义，PPARγ作为一种抑癌基因，其表达水平具有很好的临床指导意义，PPARγ高表达患者的化疗效果及2年内生存率均要优于PPARγ低表达患者，同时也表明PPARγ可以作为一种定向治疗的靶点。但由于本研究样本较小，因此还需要进行大样本前瞻性随机研究，进一步明确PPARγ表达水平的预测价值。