卵巢癌中REG4的表达及其作用机制

向莉伟，郑华川

（中国医科大学附属盛京医院实验肿瘤学实验室2，辽宁 本溪 117004）

卵巢癌的发病率居妇科恶性肿瘤第3位，病死率居首位。卵巢癌起病隐匿，缺乏早期的典型症状和成熟的早期诊断方法，且易于盆腹腔广泛种植播散，80%～85%患者还会出现复发和转移，5年生存率仅为35%～38%［1］。因此，提高对卵巢癌发生过程中基因表达变化的认识，识别新的癌症诊断生物标志物和新的治疗靶点，明确相关分子机制，可能有助于提高诊断、治疗和预防水平。再生基因（regenerating gene，REG） 家族属于钙依赖性凝集素超家族，这些蛋白在功能上类似于凝集素，具有抗凋亡因子作用，REG基因编码分泌蛋白，在糖尿病、炎症损伤自身免疫和癌瘤发生中起重要作用［2］。随着对癌症发生、发展及其机制研究的不断深入，已有文献报道再生基因4（regenerating gene family member 4，REG4）在肿瘤细胞中高表达，对肿瘤的发展、治疗和预后产生重要影响，但关于卵巢癌中REG4的表达及其分子机制少见报道。本研究旨在观察REG4在卵巢癌中的作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

pcDNA3.1-REG4表达质粒由日本东北大学再生先进生物科学系SUGAWARA教授提供；卵巢癌SKOV3细胞系购自美国ATCC公司；细胞培养试剂购自美国Gibco公司；细胞转染试剂、RNA提取试剂盒购自德国Qiagen公司；实时PCR、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、反转录酶、随机引物购自日本TaKaRa公司；REG4抗体购自美国R&D公司；FITC/PI试剂盒购自中国凯基公司；Transwell小室购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 基因表达分析:UCSC Xena 数据库集合了包括癌症基因组图谱 （The Cancer Genome Atlas，TCGA）、国际肿瘤基因组协作组 （International Cancer Genome Consortium，ICGC）、基因型-组织表达数据库 （Genotype-Tissue Expression，GTEx）、癌细胞系百科全书 （Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE） 等在内大约 200个公共数据集，进入UCSC Xena （http://xena.ucsc.edu） 网页调取TCGA、TARGET、GTEx数据库，选择sample type和ovary，输入REG4，选择Gene Expression，对REG4在卵巢的mRNA表达进行分析。调取TCGA数据库，选择sample type和ovary，再选择REG4和感兴趣的基因，分析REG4与该基因在mRNA表达水平上的关系。

1.2.2 生存分析:使用Kaplan-Meier Plotter （http://www.kmplot.com） 评估REG4mRNA表达对卵巢癌预后的影响。Kaplan-Meier Plotter分析各亚型卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率与REG4mRNA表达的关系。

1.2.3 细胞培养、转染和质粒鉴定:卵巢癌SKOV3细胞接种于含10%胎牛血清的McCoy’s 5A培养基中常规培养。取对数生长期的SKOV3细胞接种于6 cm2培养盘，待融合度达60%左右，PBS冲洗1次，加入200 μL无血清培养基。将2.4 μg质粒和9 μL转染试剂分别加入到200 μL无血清培养基，37 ℃孵育15 min后加入到培养盘中，500 mg/L遗传霉素 （geneticin，G418）筛选单克隆细胞株，实时PCR、Western blotting检测REG4表达水平，取REG4高表达单克隆细胞株用于后续实验。将稳定转染pcDNA3.1-REG4的细胞株作为过表达REG4组，稳定转染pcDNA3.1空载体的细胞作为Mock组。

1.2.4 实时PCR检测:取2组对数生长期细胞，根据QIAGEN RNase minikit 说明书提取总RNA，使用禽骨髓母细胞瘤病毒逆转录酶和随机引物对总RNA进行cDNA合成。按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书配制体系进行实时PCR反应。REG4基因扩增引物:上游5’-TAACTTGGAGCAGCAACGAATG-3’，下游5’-GGCTAGCAGAAAGGAAGAGGA-3’；内参GAPDH引物:上游5’-CAATGACCCCTTCATTGAC C-3’，下游 5’-TGGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反应条件:94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共34个循环。采用2-ΔΔCt法计算mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western blotting:用RIPA裂解液中提取卵巢癌和转染细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。按浓度稀释后95 ℃ 5 min变性。变性蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳后转膜，于5%脱脂牛奶中室温封闭1 h，加入2 mL抗REG4抗体 （美国R&D公司），4 ℃反应过夜。二抗采用HRP标记的羊抗兔的IgG，室温反应1 h，ECL-Plus试剂盒发光显影检测目的蛋白。

1.2.6 MTT法检测细胞增殖能力:将细胞接种于96孔板 （2×103/孔），每组设3个复孔，并设3个空白对照孔，常规培养。待细胞贴壁后，分别在0、24、48 h加入20 μL MTT溶液，孵育4 h后弃掉液体，并每孔加入150 μL DMSO溶解，震荡10 min，用酶标仪测定各组490 nm处吸光度值并计算增殖率，以时间为横轴、增殖率为纵轴绘制上涨曲线。

1.2.7 细胞凋亡检测:取处于对数生长期的2组细胞，收集细胞和上清液，PBS 冲洗2次，用Annexin V-FITC结合缓冲液重悬至单细胞悬液，并调整其浓度为1×106/mL。加入5 μL Annexin V-FITC染料，室温避光孵育15 min，再加入5 μL碘化丙啶染料孵育5 min，上流式细胞仪检测分析。

1.2.8 Transwell细胞侵袭实验:取处于对数生长期的2组细胞，以无血清培养基调整细胞浓度为2.5×105/mL后接种于预先涂有基质胶的Transwell小室上层，下室加入含10%胎牛血清的培养基作为化学引诱物。24 h后用棉球擦掉上层未迁移的细胞，PBS清洗小室，黏附在下层膜的细胞经4%多聚甲醛固定并用结晶紫溶液染色，光学显微镜下 （×100）选取5个随机区域照相。

1.2.9 基因富集分析:从 TCGA公共数据库收集卵巢癌、REG4基因数据，进行基因集富集分析，探讨REG4在卵巢癌发生发展中的作用和机制。

1.3 统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。满足正态性检验的计量资料以表示，采用单因素方差分析进行多组间比较，进一步两两比较采用SNK-q检验。不满足正态分布者以M（P25～P75） 表示，多组间比较采用非参数秩和检验。2组独立样本比较采用独立样本t检验，结果用3次独立实验的表示。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因表达分析

2.1.1REG4在卵巢癌组织中的表达:收集515例样本，其中正常卵巢组织88例，原位卵巢癌419例，复发性卵巢癌8例，分析REG4的表达。与正常卵巢组织相比 （均值=0），REG4mRNA表达水平在卵巢癌中上调 （均值=1.56），在复发性卵巢癌中更高 （均值=2.35）（P＜ 0.001）。见图1。

图1 REG4在卵巢癌组织中的表达Fig.1 Expression of REG4 in ovarian cancer tissues

2.1.2REG4相关基因表达:REG4的表达与Bid（r=-0.203，P＜ 0.001）、Fas（r=-0.171，P＜ 0.001）、AIF1（r=-0.272，P＜ 0.001） 等凋亡因子的表达呈明显负相关，而与细胞周期蛋白依赖激酶CDK4（r=0.205，P＜ 0.001）、抑凋亡因子Bcl-2（r=0.204，P＜ 0.001）、促增殖因子Raf（r=0.118，P=0.039） 和药物代谢相关酶ALDH1A1（r=0.121，P=0.036）、GSTA1（r=0.175，P=0.002）、GSTA2（r=0.201，P＜ 0.001）、UGT2A3（r=0.192，P＜ 0.001） 的表达呈正相关。

2.2 REG4 mRNA表达与卵巢癌患者生存率的关系

2.2.1REG4mRNA表达与所有卵巢癌患者生存率的关系:Kaplan-Meier Plotter分析结果显示，REG4mRNA的高表达与所有卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率降低相关，见图2。

图2 Kaplan-Meier曲线分析REG4 mRNA表达与卵巢癌患者总体生存率、无进展生存率和后进展生存率的关系Fig.2 The correlation between REG4 expression and overall，progression-free，and post-progression survival rates of the ovarian cancer patients according to Kaplan-Meier curve

2.2.2REG4mRNA表达与亚组卵巢癌患者生存时间的关系:组织学分型浆液性卵巢癌、临床分期Ⅰ～Ⅳ期和病理分级Ⅱ～Ⅲ级的卵巢癌患者的总体生存率与REG4mRNA的表达量呈负相关；组织学分型浆液性卵巢癌，临床分期Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ期和病理分级Ⅲ级的卵巢癌患者的无进展生存率与REG4mRNA的表达量呈负相关；临床分期Ⅲ期、病理分级Ⅱ级的卵巢癌患者的后进展生存率与REG4mRNA的表达量呈负相关；其余亚组的卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率与REG4mRNA的表达量均不相关。见表1。

2.3 过表达REG4的SKOV3细胞表型

表1 Kaplan-Meier Plotter检测REG4 mRNA对卵巢癌预后的影响Tab.1 The prognostic significance of REG4 mRNA in ovarian cancer estimated using Kaplan-Meier Plotter

通过G418筛选，成功获得了稳定高表达REG4的单克隆细胞株SKOV3。实时PCR结果显示，过表达REG4组细胞REG4mRNA的表达水平明显高于Mock组 （P＜ 0.001），Western blotting结果表明，REG4组细胞REG4蛋白的表达水平明显高于Mock组 （P＜0.05），表明其已稳定高表达REG4。见图3A。

MTT结果显示，过表达REG4的SKOV3增殖能力明显高于Mock组 （P＜ 0.05），表明REG4过表达可促进卵巢癌细胞SKOV3的增殖能力。见图3B。

流式细胞仪结果显示，REG4过表达的卵巢癌细胞SKOV3凋亡减少 （P＜ 0.05），表明过表达REG4可抑制卵巢癌细胞SKOV3的凋亡。见图3C。

Transwell结果显示，过表达REG4的SKOV3穿膜细胞数量明显高于Mock组 （P＜ 0.05），表明REG4过表达可促进卵巢癌细胞SKOV3的侵袭能力。见图3D。

2.4 基因富集分析

REG4在凋亡和药物代谢细胞色素P450相关基因中富集。且REG4与凋亡相关基因呈明显负相关，而与药物代谢细胞色素P450相关基因呈正相关。见图4。

3 讨论

人REG4基因定位于染色体1q12-q21，编码158个核苷酸，蛋白分子量为17 000［2］。本研究发现，REG4mRNA在卵巢癌组织中表达升高，在胃癌、结直肠癌、大肠癌、胰腺导管腺癌等多种人类恶性肿瘤中均发现REG4mRNA和蛋白表达升高［3-4］，提示REG4表达上调参与人类恶性肿瘤的发生。人卵巢癌细胞SKOV3过表达REG4蛋白后，细胞增殖增强，凋亡抑制。BISHNUPURI等［5］发现，REG4蛋白激活Akt/GSK3β/β-Catenin/TCF-4和EGF受体/Akt/AP-1信号通路，增加细胞周期调控基因Cyclin D1和Cyclin D3以及相关的周期蛋白依赖性激酶 （CDK4和CDK6）的表达，从而促进肿瘤细胞增殖。生物信息分析发现，REG4与周期蛋白依赖性激酶CDK4的表达呈正相关，同时基因富集结果显示，REG4相关基因抑制凋亡信号通路，且REG4的表达与Bid、Fas、AIF1等凋亡因子的表达呈负相关，与抑凋亡因子Bcl-2的表达呈正相关。BISHNUPURI等［5］的研究也证明了REG4处理结直肠癌细胞后，Bcl-2、Bcl-XL和Survivin蛋白表达增加，表明REG4能够通过调节细胞增殖和凋亡参与肿瘤发生。

图3 REG4过表达对卵巢癌恶性细胞表型的影响Fig.3 The effects of REG4 overexpression on the aggressive phenotypes of ovarian cancer cells

图4 依据KEGG的REG4表达相关基因富集的信号传导通路分析Fig.4 Signal pathway analysis of REG4-related genes according to KEGG

卵巢癌患者的生存与卵巢癌的复发和转移密切相关。生存分析显示，亚临床分型和分级的卵巢癌中，REG4表达水平与患者生存率呈负相关。OUE等［6］发现，大肠癌中REG4的表达与肿瘤分期相关，Ⅲ/Ⅳ期大肠癌中REG4表达频率高于Ⅰ/Ⅱ期，且直肠癌与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移和肝转移密切相关。SAUKKONEN等［7］发现，胰腺导管腺癌中REG4的表达与肿瘤的组织学分级有关，且在肿瘤ⅠA～ⅡA期中，REG4血清水平高的患者生存期较差。本研究发现，过表达REG4的卵巢癌细胞侵袭增强。HE等［8］发现，REG4蛋白能诱导基质金属蛋白酶7和基质金属蛋白酶9两种细胞侵袭因子表达上调。此外，本研究中REG4高表达的卵巢癌患者的总体生存率、无进展生存率和后进展生存率较低，且复发性卵巢癌患者REG4的表达高于原发性卵巢癌患者。以上数据表明，REG4可能参与卵巢癌的侵袭和转移，并因此降低卵巢癌患者的生存率。

本研究中，REG4相关基因表达分析发现，REG4与ALDH1A1、GSTA1、GSTA2、UGT2A3等药物代谢相关酶的表达呈正相关，基因富集分析显示，REG4与药物代谢细胞色素P450相关基因密切相关。JIN等［9-10］发现，REG4蛋白能够调控 Hsp27、Bcl-2的表达以及多种酪氨酸激酶受体等关键信号分子的激活，从而介导肿瘤细胞对化疗药物的耐受作用。总之，REG4不利于肿瘤的药物治疗。

综上所述，REG4能够促进肿瘤细胞周期进程、增殖和侵袭，抵抗凋亡，并能够提高肿瘤细胞对化疗药物的耐受水平，与卵巢癌的不良预后密切相关，可作为卵巢癌早期诊断、预后评价和晚期基因治疗一个新的分子靶点，以提高卵巢癌患者生存率和生存质量。