不同产地乌饭树叶中黄酮成分含量差异研究

黄 婧，赵 青，周 鹏，张 敏*

(1.江苏省林业科学研究院，江苏 南京 211153； 2.南京林业大学，江苏 南京 210037)

乌饭树(VacciniumBracteatumThunb.)广泛分布于我国南方各地，是苏南丘陵山区重要的特色乡土树种[1]，作为传统的食药两用植物，具有极大的开发利用价值。据我国历代典籍记载与民间流传，可用乌饭树叶汁浸米制作乌饭、乌米糕等食品。长江以南地区有每年寒食节食用乌饭的习俗，人们认为经常食用可以提高免疫力、延年益寿[2]。乌饭树的药用历史悠久，《中国药典》中记载有“强筋身骨，益气固精驻颜”的功效[3]。乌饭树叶片富含黄酮类化合物[4]，具有很高的营养价值和保健功能，也是当前研究开发的热点。许多研究对乌饭树叶片黄酮类化合物的组成和含量进行了定性定量的分析，并研究了其抗氧化、治疗疾病等作用[5-9]。

为了更好地开发利用乌饭树作为药食同源特色林木的价值，开展乌饭树叶片黄酮类活性成分含量的分析与评价，对不同产地乌饭树叶黄酮成分进行评价，从中筛选出最佳产地，可以为乌饭树资源开发利用提供理论依据，也可为乌饭叶的黄酮化合物利用与产品研发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所用试验材料为乌饭树叶片，试验材料采自湖南白云山(中亚热带北缘)、安徽黄山(中亚热带北缘)、江西上犹(亚热带南缘)、江苏溧阳(中亚热带北缘)、安徽宣城(中亚热带北缘)5个地区，于9月至次年4月每月中旬采样，每一区域标记健壮植株5株，每株采集当年生枝条萌发的成熟叶片约10 g，混匀后用硅胶保存带回实验室，擦拭干净后置于烘箱，60 ℃烘至恒重，研磨至粉末状，过60目筛，用于后续检测。

表1 乌饭树产地经纬度

1.2 试验方法

1.2.1 三氯化铝显色法测定总黄酮含量 试验方法参照王立等[10]。

(1)制作标准曲线：精密称量槲皮素标准品10 mg，以50%乙醇溶液为溶剂配置0.2 mg/mL的标准液，备用。取标准液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL置于25 mL容量瓶中，加入5 mL 1% AlCl3溶液和1 mL 10% NaAc溶液，用50%乙醇溶液定容。10 min后测量390 nm 处吸光度，对照为空白试剂，制作标准曲线。得到槲皮素溶液的质量浓度X(mg/mL)与吸光度Y的线性回归方程为Y=2.719 3X-0.001 3，R2=0.999 7。

(2)叶片黄酮提取液：精密称取乌饭树叶干燥粉末1.000 g，加入50%乙醇溶液20 mL，料液比为1∶20(g∶mL)，60 ℃水浴中超声60 min(每10 min摇动1次)，趁热减压过滤，50%乙醇溶液冲洗滤渣多次，滤液用50%乙醇溶液定容至25 mL。3次平行重复，取平均值。

(3)叶片黄酮含量测定：量取0.5 mL黄酮提取液，加入5 mL 1% AlCl3溶液和1 mL 10% NaAc溶液，用50%乙醇溶液定容至25 mL，10 min后测量390 nm 处吸光度，通过标准曲线方程计算样品溶液中黄酮含量(mg/mL)，换算成总黄酮质量分数(mg/g)。

1.2.2 高效液相色谱法测定类黄酮各成分的含量 试验方法参照刘知远等[11]。

(1)色谱条件：色谱柱：Eclipse Plus C18(2.1×100 mm，1.8 μm)；流动相：甲醇-0.2% 磷酸溶液(554∶45)；流速：0.200 mL/min；检测波长：360 nm；进样量：1.0 μL；进样时间：10 min；柱温：30 ℃。

(2)标准溶液的配制：分别精密称取槲皮素12 mg、木犀草素11 mg、山柰酚9 mg、芹菜素10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇-盐酸(体积比10∶1)定容，作为储备液备用；取槲皮素储备液2.0 mL、木犀草素储备液1.0 mL、山柰酚储备液0.4 mL、芹菜素储备液1.0 mL，用甲醇-盐酸(体积比10∶1)溶液定容至50 mL，0.45 μm滤膜过滤后得标准溶液。

(3)样品溶液的制备：精密称取乌饭树叶干燥粉末1.000 g，加入甲醇-盐酸(体积比10∶1)混合溶液20 mL，60 ℃水浴中超声1 h(每10 min摇动1次)，趁热减压过滤，滤液用甲醇-盐酸(体积比10∶1)溶液定容至25 mL，0.45 μm滤膜过滤后上机检测。

(4)样品测定：样品的定性分析参照标准品的保留时间确定，类黄酮各成分的含量采用标准曲线法计算。

1.2.3 数据分析 采用SPSS 25进行单因素方差分析和相关性分析。以总黄酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素含量为指标，采用模糊数学隶属函数法[12]对不同产地乌饭树叶的营养品质进行综合评价，每个营养指标的隶属函数值按公式Zij=(Xij-Ximin)/(Ximax-Ximin)计算，并由此得出平均隶属函数值。其中，Zij代表i产地的j指标的隶属函数值；Xij代表i产地j指标的测定值；Ximin和Ximax分别代表各产地营养物质指标值的最大值和最小值。

2 结果与分析

2.1 不同产地乌饭树叶中总黄酮含量差异

5个产地乌饭树叶中总黄酮含量的平均值为9.964 mg/g(见图1)，不同产地乌饭树叶总黄酮含量差异极显著(P<0.01)，其中江苏溧阳的乌饭树叶中总黄酮含量最高，达17.942 mg/g，其次是江西上犹和安徽宣城产的乌饭树叶，其总黄酮含量分别为11.033，8.685 mg/g。总黄酮含量最低的是湖南白云山和安徽黄山产的乌饭树叶，分别为5.994，6.166 mg/g。

注：不同大写字母表示极显著性差异(P<0.01)。图1 不同产地乌饭树叶中总黄酮含量差异

2.2 不同产地乌饭树叶中4种类黄酮成分含量差异

利用高效液相色谱仪可以同时测定出乌饭树叶中的4种类黄酮成分，分别是槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素，标准品色谱图如图2所示。

(4.273：槲皮素;5.130：木犀草素;6.959：山柰酚；7.617：芹菜素)图2 类黄酮标准品超高效液相色谱图

5个产地乌饭树叶中类黄酮各成分含量如图3所示，5个产地乌饭树叶的槲皮素含量平均值为3.126 mg/g，木犀草素含量的平均值为0.021 mg/g，山柰酚的平均含量为0.296 mg/g，芹菜素含量的平均值为0.069 mg/g，不同产地间各成分含量差异显著(P<0.05)。

注：同图中不同小写字母表示结果存在显著性差异(P<0.05)。图3 不同产地乌饭树叶中槲皮素、木犀草素、山柰酚和芹菜素含量差异

槲皮素含量最高的乌饭树叶产自江苏溧阳，为6.490 mg/g，其次是江西上犹，其槲皮素含量为4.896 mg/g；含量最低的产地是安徽黄山，为0.776 mg/g；湖南白云山和安徽宣城产的乌饭树叶槲皮素含量也较低，分别为1.052,2.417 mg/g。

木犀草素含量最高的乌饭树叶同样产自江苏溧阳，达0.036 mg/g，其次是安徽宣城和江西上犹，含量分别为0.022，0.021 mg/g；含量最低的产地是安徽黄山，为0.012 mg/g；湖南白云山产的叶片木犀草素含量也较低，其值为0.016 mg/g。

江西上犹产的乌饭树叶中山柰酚含量最高，达1.350 mg/g，其他地区乌饭树叶所含的山柰酚均显著低于江西上饶(P<0.05)，含量最低的产地是安徽黄山，仅为0.006 mg/g。

江苏溧阳产的乌饭树叶中芹菜素含量最高，达到0.191 mg/g，其次是江西上犹和湖南白云山产的乌饭树叶，其芹菜素含量分别为0.071，0.047 mg/g；安徽宣城和安徽黄山产地的芹菜素含量较低。

2.3 4种类黄酮成分及总黄酮含量的相关性分析

不同产地乌饭树叶槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素含量以及总黄酮含量之间的相关性分析结果如表2所示。除了山柰酚与总黄酮含量无相关性，其他3种类黄酮成分均与总黄酮呈正相关：槲皮素与总黄酮之间、芹菜素与总黄酮之间均存在着显著的正相关(P<0.05)，相关系数分别达0.956，0.946；木犀草素与总黄酮存在极显著正相关(P<0.01)，相关系数达0.962。此外，木犀草素与槲皮素存在显著的正相关(P<0.05)，相关系数为0.895；木犀草素与芹菜素之间存在显著的正相关(P<0.05)，相关系数达0.909；山柰酚与其他3种类黄酮成分均不相关。

表2 4种类黄酮成分及总黄酮含量的相关性分析

2.4 不同产地乌饭树叶营养品质综合评价

以乌饭树叶中总黄酮、槲皮素、山柰酚、木犀草素、芹菜素含量为指标，采用模糊数学隶属函数法对不同产地间乌饭树叶的营养品质进行综合比较。平均隶属函数值越大，说明该产地乌饭树叶中的营养物质含量综合值越高，品质越好。

由表3可以看出，江苏溧阳产乌饭树叶的平均隶属函数值位列第一，其值为0.806；其次为江西上犹和安徽宣城产乌饭树叶，平均隶属函数值分别0.568，0.202，分别位列第二和第三；排名靠后的为湖南白云山和安徽黄山产乌饭树叶，尤其是安徽黄山的乌饭树叶平均隶属函数值仅为0.003，排名最后。说明乌饭树叶中总黄酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素综合品质最佳的产地为江苏溧阳，较优的有江西上犹和安徽宣城，较差的为湖南白云山和安徽黄山。

表3 不同产地乌饭树叶4种类黄酮及总黄酮含量分析与评价 mg/g

3 讨论

黄酮类化合物具有很高的保健和药用价值，是乌饭树叶片的主要活性成分之一[4]，也是乌饭树叶片开发利用的研究重点。本研究分析了不同产地乌饭树叶中总黄酮含量、槲皮素、木犀草素、芹菜素的含量差异，以期为乌饭树高黄酮品种的产地选择提供依据。类黄酮是一种植物次生代谢产物，槲皮素、木犀草素、山柰酚以及芹菜素均为天然黄酮类化合物，普遍存在于常见的可食植物中[13]。植物中总黄酮和类黄酮化合物含量的积累受到内、外界因素的显著影响[14]。已有研究表明，江西省内越靠近南部产地的乌饭树叶片中总黄酮含量越高[15]，湖南汨罗产的乌饭树叶黄酮含量显著高于江西南昌[16]。不同产地间的黄岑[17]、金银花[18]以及紫花杜鹃[19]的类黄酮成分含量差异较大。本研究选择湖南白云山、安徽黄山、江西上犹、江苏溧阳、安徽宣城5个具有乌饭制作和食用传统的地区作为材料源地，分析发现不同产地乌饭树叶中总黄酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚以及芹菜素的含量差异显著(P<0.05)，与其他植物中的研究结果类似。乌饭树叶中主要生物活性成分在各产地间存在较大程度的变异，这种变异意味着乌饭树具有丰富的遗传多样性，这可能是乌饭树自身的生理特性以及生长环境因素共同作用的结果，同时这种变异也证实了进行优良种源的筛选有着重要的意义。

环境胁迫对植物次生代谢产物的影响或许可以解释不同产地间植物类黄酮与游离氨基酸含量的差异。许多研究表明，低温、高盐、强光照、脱水等环境胁迫能够促进植物体内类黄酮含量的积累[20-22]。因此，可以推测乌饭树叶黄酮类化合物成分在各产地间存在较大程度的变异，可能与环境因素如温度、光照、土壤性质等相关，具体原因还需要开展进一步研究。丰富的变异意味着乌饭树具有丰富的遗传多样性，这可能是乌饭树自身的生理特性以及生长环境因素共同作用的结果，同时这种变异也证实了进行优良产地的筛选有着重要的意义。

模糊数学隶属函数法常被用于蔬菜营养品质的综合评价，张传伟等[23]采用模糊数学隶属函数法对25个品种(系)番茄中的优良品质和不良品质进行了综合评价；杨利[24]采用隶属函数法对萱草属(Hemerocallis)植物中的可溶性蛋白、总糖、总游离氨基酸维生素C等多个营养指标进行了综合评价。本研究采用模糊数学隶属函数法分别计算每个产地乌饭树叶的平均隶属函数值，从而对不同产地间乌饭树叶的营养品质进行综合比较，江苏溧阳产乌饭树叶的平均隶属函数值位列第一，其次为江西上犹和安徽宣城产乌饭树叶，湖南白云山产乌饭树叶排名第4，安徽黄山的乌饭树叶平均隶属函数值排名最后。因此乌饭树叶中总黄酮、槲皮素、木犀草素、山柰酚、芹菜素综合品质最佳的产地为江苏溧阳，较优的有江西上犹和安徽宣城，湖南白云山和安徽黄山的乌饭树叶资源品质较差。江苏溧阳可作为优良药用与食用种源进行深入开发与利用。