载脂蛋白M在非小细胞肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭中的作用

王子谨，张晓膺

（苏州大学附属第三医学院心胸外科，江苏 常州 213003）

目前，人类所有癌症中以肺癌的发病率最高，2018年全球新增肺癌病例占所有癌症的11.6%[1]。肺癌也是死亡率最高的癌症，2018年全球肺癌患者死亡例数占全部死亡例数的18.4%[2]。肺癌分为2种组织学亚型：小细胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。NSCLC约占所有肺癌的85%，是最主要的肺癌亚型。深入研究肺癌的发生、发展，探寻新的独立标志物对肺癌的诊疗有重大意义。载脂蛋白M（apolipoprotein M，apo M）是1999年被XU等[3]从乳糜微粒中分离并克隆的一种新型载脂蛋白。近年来，有许多研究结果显示，载脂蛋白家族参与了多种肿瘤的发生、发展及预后[4-6]。为此，apo M对NSCLC发生、发展的影响值得进一步研究。另外，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）家族与肺癌的增殖、侵袭及转移相关[7]，其中MMP-3、MMP-10、MMP-11在NSCLC中过表达[8]，且MMP-10已被证明是NSCLC发生、发展所必需的[9]。本研究旨在探讨apo M对NSCLC A549细胞株增殖、迁移、侵袭能力的影响及其与MMP-10的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞系和主要试剂

NSCLC A549细胞系购自中国科学院细胞库。Dulbecco改良Eagle培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM）购自美国康宁公司。胎牛血清购自美国赛默飞世尔公司 。慢病毒包装及相关转染试剂购自上海吉凯基因公司。RNA提取试剂盒（RNAiso Plus Reagent）购自上海申能博彩试剂公司。总蛋白提取试剂盒、二喹啉甲酸（bicinchonininc acid，BCA）蛋白定量试剂盒购自上海贝博生物公司。apo M、MMP-10抗体购自英国abcam公司。CCK-8试剂盒购自日本DojinDo公司。CX43型电子显微镜购自日本OLYMPUS公司。DM2500型共聚焦荧光显微镜购自德国Leica 公司。

1.2 细胞培养及慢病毒转染

将A549细胞置于含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养。显微镜下估计细胞密度，当细胞密度为70%时，胰酶消化后重悬细胞，原细胞皿数∶传代后细胞皿数按1∶5传代继续培养。根据试剂说明书要求进行apo M过表达和空载慢病毒感染。将A549细胞接种于6孔板中（2×105个细胞/mL），细胞达到50%融合度后，更换含有慢病毒的细胞培养基，并加入慢病毒感染增强液[ENI.S和polybrene，即Polybrene（E）]4 μL，以促进慢病毒转染。成功感染的细胞为绿色荧光蛋白阳性，72 h后在荧光显微镜下观察并使用实时荧光定量聚合酶链反应（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）评估apo M过表达的效率。以转染空慢病毒的细胞作为阴性对照。

1.3 qRT-PCR检测

采用Trizol试剂提取总RNA，然后采用MMLV逆转录酶逆转录合成互补DNA（complementary DNA，cDNA）。 使用SYBR Premix Ex Taq试剂（日本TAKARA公司）进行qRT-PCR。循环参数：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。检测仪器为QuantStudio 6实时荧光定量PCR仪（美国ThermoFisher Scientific公司）。采用2-△△Ct计算mRNA相对表达量。apo M、MMP-10基因及内参基因的引物及探针序列见表1。

表1 apo M基因、MMP-10基因及内参基因的引物及探针序列

1.4 采用CCK-8法检测细胞增殖倍数

转染成功24 h后收集细胞，将细胞分为阴性对照组（转染空慢病毒）及apo M-OE组（转染apo M慢病毒）。根据细胞计数结果，用完全培养基将2个组的细胞制成4×104个/mL的细胞悬液。取4块96孔板，每孔加入100 μL制备好的细胞悬液，分别于0、24、48、72 h使用CCK-8法检测apo M-OE组和阴性对照组的细胞增殖倍数。用含10%胎牛血清的DMEM培养基将CCK-8溶液按1∶9比例稀释，以此稀释液代替待测孔中的培养基，于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养1～4 h，检测450 nm处的吸光度（A）值，计算细胞增殖倍数。

1.5 划痕实验

转染24 h后，在6孔板中接种（2×105个细胞/mL）并孵育48 h，细胞密度达到70%后，用10 μL加样枪枪头在孔板中心轴处划痕过底板，使用磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）快速清洗2遍后，加入含1%血清的培养液，于0、24、48、72和96 h取样摄片，记录划痕间距并计算闭合速率。

1.6 Transwell细胞侵袭实验

转染成功24 h后收集细胞，将细胞分为阴性对照组（转染空慢病毒）及apo M-OE组（转染apo M慢病毒）。将所有细胞在无血清培养基中培养12 h后消化，PBS清洗2遍，重悬于含10 g/L牛血清白蛋白的无血清培养基中。Transwell细胞侵袭实验在24孔8 mm Transwell板中进行，上室加入1×105个细胞，无血清培养，下室加入10%血清培养基，在37 ℃、5%CO2条件下培养48 h。甲醇固定，结晶紫染色，PBS清洗，在DM2500型共聚焦荧光显微镜下观察并计数。

1.7 免疫印迹法检测细胞apo M和MMP-10相对表达量

收集阴性对照组和apo M-OE组细胞，PBS清洗3次后，使用含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，采用BCA法进行定量检测。100 ℃变性5 min后采用10%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）分离30 mg蛋白质样本。将蛋白质转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，采用5%BSA 4 ℃封闭过夜后，依次孵育相应的一抗和二抗。最后进行显色并统计灰度值，计算相对表达量。

1.8 统计学方法

采用GraphPad 5.0软件进行统计分析。所有实验均独立重复3次。组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 apo M-OE组与阴性对照组apo M表达的比较

apo M-OE组和阴性对照组细胞转染情况见图1（a）。与阴性对照组相比，apo M-OE组apo MmRNA相对表达量明显上调（P＜0.01），约为阴性对照组的28倍，见图1（b）。

图1 A549细胞的转染情况及apo M mRNA的表达水平

2.2 过表达apo M对A549细胞增殖的影响

转染24及48 h后，apo M-OE组细胞增殖倍数明显高于阴性对照组（P＜0.001）；转染72 h时，apo M-OE组增殖速率与阴性对照组一致，推测为细胞增殖过多堆叠所致。见图2。

图2 过表达apo M对A549细胞增殖的影响

2.3 过表达apo M对A549细胞迁移、侵袭的影响

划痕实验结果显示，与阴性对照组比较，从48 h开始，apo M-OE组A549细胞空白视野显著减少，闭合速率显著加快，即细胞迁移率更大（P＜0.001）。见图3。

Transwell细胞侵袭实验结果显示，培养48 h后，apo M-OE组A549细胞侵袭率显著高于阴性对照组（P＜0.001）。见图3。

图3 过表达apo M对A549细胞迁移、侵袭能力的影响

2.4 apo M-OE组和阴性对照组细胞中MMP-10的表达

采用qRT-PCR及免疫印迹法检测apo MOE组和阴性对照组细胞MMP-10 mRNA及蛋白的表达。结果显示，apo M-OE组MMP-10 mRNA及apo M、MMP-10蛋白表达量显著高于阴性对照组（P＜0.05）。见图4、图5。

图4 apo M-OE组和阴性对照组apo M的表达

图5 apo M-OE组和阴性对照组MMP-10的表达

3 讨论

截止到2015年，在我国成年男性中，肺癌的年发病率及年死亡率均居第1位，每年新发病例为73.3万，其中男性为48.9万例；每年约有59.1万例患者死于肺癌，其中男性为40.2万例[10]。由此可见，深入研究肺癌的发生、发展，探寻新的独立标志物刻不容缓。

有研究结果显示，apo M可能参与了肿瘤的发生、发展[11-12]。JIANG等[11]的研究结果显示，肝癌患者血浆apo M水平高于正常对照组（P＜0.01）。有研究结果显示，肠癌组织中apo MmRNA及蛋白水平明显低于正常组织及良性病变组织（P＜0.05），结直肠癌组织中apo MmRNA表达水平与淋巴结转移有关[12]。由此可见，apo M与肿瘤的发展有关，且在不同肿瘤中表现出促进或抑制作用。本研究结果显示，apo M过表达对A549细胞的增殖、迁移、侵袭能力均表现出促进作用，这提示apo M可能通过某些复杂机制促进NSCLC的发展。

MMP与肿瘤的发展和转移有关。有研究结果显示，MMP-10在NSCLC和经Kras转化的BASC肺癌起始细胞中过表达[13]。体外实验结果显示，MMP-10是NSCLC转化生长及侵袭所必需的[8]。MMP-10在体内实验中也表现出同样重要的作用[13]。

ZHANG等[14]的研究结果显示，与正常组织比较，肺癌组织MMP-10 mRNA水平显著降低（P＜0.05），MMP-10蛋白水平显著升高（P＜0.01）。ZHU等[15]的研究结果显示，肺癌组织中apo MmRNA及蛋白水平均显著高于正常组织，apo M可促进A549细胞的增殖和侵袭，其机制为apo M通过上调鞘氨醇-1-磷酸受体-1（sphingosine-1-phosphate receptor-1，S1P1）并激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK1/2）和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositide-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称Akt）通路来参与NSCLC的生长调节。PI3K/Akt通路可调节多种转录因子，并参与肿瘤的发生、发展[16]。另外，apo M还可通过与1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate，S1P）结合等作用参与动脉粥样硬化和炎症刺激等[17]，且MMP-10也与此相关[18]。提示apo M与MMP-10可能存在某种联系。本研究结果显示，过表达apo M的A549细胞中MMP-10 mRNA和蛋白表达明显上调。这提示在A549细胞中，apo M与MMP-10存在联系，并有可能存在复杂的调节机制。

ZHANG等[19]的研究结果显示，IL-6可通过人肺腺癌细胞系中两面神激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信号传导及转录激活因子-3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）信号通路调节MMP-10的表达。还有研究结果显示，apo M的表达受激素水平、炎性因子及生长因子等诸多因素的调节[20-21]，其与IL-6呈负性调节关系。本研究分别对转染apo M慢病毒的A549细胞和转染空慢病毒的A549细胞进行了细胞增殖实验、细胞划痕实验和Transwell细胞侵袭实验。结果显示，过表达apo M可促进A549细胞增殖、迁移及侵袭，还可上调MMP-10的表达。但apo M在NSCLC中的作用机制及通路尚待进一步研究。除了本研究进行的apo M过表达研究外，干扰A549细胞中的apo M表达是否会产生影响，apo M对除A549外的其他肺癌细胞系是否具有相似作用，均是下一步研究的目标。另外，后续将对apo M与MMP-10相互作用的信号通路进行研究，包括在过表达apo M的A549细胞中使用MMP-10阻滞剂，观察其细胞功能学改变以及扩大实验对象，采用多种处理因素观察结果等。

综上所述，apo M过表达可促进A549细胞的增殖、迁移和侵袭，并上调A549细胞中MMP-10的表达。