黄花败酱有效成分提取及其体外抗氧化研究

刘 伟，武 贺，张巧群，秦锌悦，关晓暄

黄花败酱（Patrinia scabiosaefolia Fisch），是败酱草中的一种，属于败酱科败酱属植物，主要产于吉林、黑龙江、辽宁、内蒙古等地.其性属于微寒，味道苦、辛，归肺、大肠、肝经，具有清热解毒、破瘀排脓的作用［1］.随着对黄花败酱的深入研究，目前已经确定，败酱草中主要含有皂苷类、黄酮类、甾醇、环烯醚萜和挥发油类等多种主要的药用成分［2］.黄花败酱中通常以皂苷类物质成分为主，在原料中其含量达到7.02%［3］，其黄酮含量只达到2.35%［4］.黄酮类化合物是一类存在于植物中具有还原性的化合物，在植物体外和体内都有较强的抗氧化性和药理作用，对人毒副作用较小，实验证明，黄酮类化合物还具有降血糖、降血脂、抗心律失常、加强机体免疫力等保健功能.本实验以正交实验设计，测定黄酮含量和总皂苷含量（以齐墩果酸计），以获得提取黄花败酱有效成分的最佳方式，提高有效成分得率，并进一步测定抗氧化作用，为开发黄花败酱资源奠定理论基础.

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

黄花败酱采自吉林省通化市白鸡峰国家森林公园，由通化师范学院张立秋老师鉴定确认.芦丁标准品（北京索莱宝），DPPH（合肥博美生物），其余试剂均为分析纯试剂.

1.2 方法

（1）黄花败酱有效成分的提取.将新鲜黄花败酱全草在室内阴干，研磨成粉末，以试剂类型、试剂用量、抽提时间（2 h 一次）为因素进行正交试验［4］，抽提温度为100 ℃，具体情况如表1 和表2 所示.用滤纸包裹黄花败酱粉末，装入提取管，向提取瓶加入相应试剂，组装好索氏抽提器，100 ℃抽提，第一次虹吸出现时计时，所得提取液使用旋转蒸发仪浓缩，经细菌滤器（0.2 μm）过滤并以无菌水定容至1 g/mL.

表1 因素水平表

（2）黄花败酱黄酮含量的测定.用70%乙醇配制浓度为0.1 mg/mL 的芦丁标准品溶液，精确吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL 芦丁标准品溶液，加入5%亚硝酸钠溶液0.08 mL，摇匀放置6 min 后，加入10% 硝酸铝溶液0.08 mL 后，摇匀放置6 min，再加4%氢氧化钠溶液1.00 mL，加水稀释至2.5 mL，摇匀放置15 min 后，以不加芦丁的空白为对照比，测定510 nm 处吸光度，绘制成标准曲线［6］.精确吸取10 倍样品稀释溶液0.5 mL，测定其吸光度，依据标准曲线测得样品中黄酮的含量，依据文献［5］计算黄酮含量.

（3）黄花败酱中齐墩果酸含量的测定.用分析天平精确称取齐墩果酸标准品0.2 g，加入甲醇溶解稀释并定容至10 mL，精确吸取上述溶液1 mL，加入甲醇定容至100 mL，制成齐墩果酸标准品溶液（0.2 mg/mL）.分别吸取10倍稀释液和标准品溶液各0.5 mL，加热使溶剂全部蒸发，加入5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min.冰水冷却2～3 min，加入冰醋酸5 mL.酶标仪190～900 nm 上扫描，可得紫外吸收光谱.易知供试品最大吸收波长548 nm，与齐墩果酸标准品一致.参照文献［6］方法绘制标准曲线.

（4）黄花败酱乙醇提取物的体外抗氧化研究.分别配制2.5～40 mg/mL 不同浓度黄花败酱乙醇提取物，超氧阴离子自由基清除率采用邻苯三酚自氧化法进行测定，DPPH·清除实验参照文献［7］方法.

2 结果与分析

2.1 黄花败酱乙醇提取物中黄酮含量的测定

利用芦丁标准品绘制曲线为Y=0.0475X+0.0294，R=0.9944.

表2 黄花败酱中黄酮提取试验设计及结果

由表2 可知，不同因素水平对黄花败酱黄酮提取的影响由大到小分别为C>A>B.根据正交试验初步确定黄花败酱中黄酮的最佳提取工艺条件为A3B1C2，即乙醇浓度95%、料液比1∶7.5、时间4 h.

2.2 黄花败酱乙醇提取物中齐墩果酸含量的测定

利用齐墩果酸标准品绘制曲线为Y=0.1031X+0.0985，R=0.994.黄花败酱中齐墩果酸提取试验设计结果如表3 所示.

表3 黄花败酱中齐墩果酸提取试验设计及结果

由表3 可知，不同因素对黄花败酱中齐墩果酸提取的影响由大到小分别为A>C>B.根据正交试验初步确定败酱草中黄酮类物质最佳提取工艺条件为A1B3C3，即乙醇浓度100%、料液比1∶10、时间6 h.

2.3 黄花败酱乙醇提取物对DPPH·、超氧阴离子自由基清除率的影响

以正交实验设计的9 组实验提取物中黄酮及齐墩果酸含量最高的3、7、8 号样品为材料，制备2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 浓度的稀释液，分别测定其对DPPH·、超氧阴离子自由基和羟自由基清除率的影响.结果表明，黄花败酱乙醇提取物对DPPH·清除率较高，当样品浓度为40 mg/mL 时，DPPH·清除率可达80%，且存在剂量依赖性（见图1）；当样品浓度为10 mg/mL 时对超氧阴离子自由基清除率可达到90%（见图2）.

图1 黄花败酱乙醇提取物对DPPH·清除率

图2 黄花败酱乙醇提取物对超氧阴离子清除率

3 讨论

本文确定当条件为乙醇浓度95%、料液比1∶7.5、时间4 h 黄酮提取效率最高，含量为23.444 mg/mL，条件为乙醇浓度100%、料液比1∶10、时间6 h 齐墩果酸提取效率最高，含量为8.501 mg/mL，这与文献［8］报道的结果基本一致.体外抗氧化实验表明，黄花败酱乙醇提取物抗氧化活性较好，DPPH·自由基清除率可达79.08%，超氧阴离子自由基清除率可达90%，这要高出文献［9］报道的抗氧化活性，但其中的抗氧化活性物质及作用机制还有待进一步研究.