检测抗缪勒氏管激素的方法学性能验证报告

张莹 王晓芳 徐进

【摘要】目的 分析康润公司的酶联免疫法（ELISA）定量检测抗缪勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）的方法学性能，评价其是否与试剂盒说明书中性能质量结果相一致。方法根据实验室认可准则和美国 CLIA88 性能验证文件，选取河南省人民医院生殖中心患者血清，分别用罗氏E601型全自动电化学发光仪器和DS-2全自动酶免疫仪检测患者血清AMH水平，比较同一份标本用两种方法检测的精密度、正确度、可报告范围和线性范围。结果 康润酶联免疫法的抗缪勒氏管激素定量检测试剂盒批内精密度、批间精密度、正确度、可报告范围和线性范围等均符合要求。结论 康润公司的酶联免疫法检测AMH的试剂盒的性能较好，与试剂说明书中性能质量结果相一致，适用于开展临床应用。

【关键词】抗缪勒氏管激素、电化学发光法、酶联免疫法

【中图分类号】R122.1   【文献标识码】A    【文章編号】2107-2306（2020）03-278-02

抗缪勒氏管激素（anti-mullerian hormone，AMH）是转化生长因子 β（TGF-β）超家族中的二聚体糖蛋白，参与调节组织生长和分化1，又称为缪勒氏管抑制物。在女性体内，AMH主要由卵巢颗粒细胞分泌，于初级卵泡的颗粒细胞最早开始表达，并持续整个卵泡的发育过程，AMH在卵巢的卵泡发育中发挥重要作用2。本研究探讨电化学发光法和酶联免疫法定量检测AMH结果的重复性、精密度、正确度、可报告范围和线性区间，以满足临床检测和认可组织的要求，报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料随机选取河南省人民医院生殖中心患者血清。入选标准：按各性能指标要求选入血清样本，要求全部为新鲜血清样本，选取的样本检测值尽量覆盖全线性范围，每例样本需至少500μl，评估精密度的样本需至少1000μl。避免溶血、脂血及黄疸样本。本研究经河南省伦理委员会批准通过，研究对象均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂 分别用罗氏E601型全自动电化学发光仪器及罗氏配套AMH试剂和DS-2全自动酶免仪及广州康润生物科技有限公司抗缪勒氏管激素（AMH）定量检测试剂盒（酶联免疫法）检测患者血清AMH水平，均按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.2批内精密度分析：批内精密度是指同一样品的多个复管在一次测定中的重现性，变异系数（CV）小于10%。按照实验室操作规程，低值（L）、中值（M）AMH质控品（或样本）各1例，检测2个水平的质控品（或样本），每个质控品（或样本）重复检测20次，分别计算高低两个浓度质控品（或样本）检测的CV值，变异系数（CV）=标准差SD/均数x100%。

1.2.3批间精密度分析：批间精密度是指同一样品在多批测定间的重现性，CV%小于15%。按照实验室操作规程，低值（L）、中值（M）AMH质控品（或样本）各1例，检测2个水平的质控品（或样本），每个质控品（或样本）重复检测4次，复孔检测，连续检测5日，分别计算高低两个浓度质控品（或样本）检测的CV值。

1.2.4  正确度验证：目前常用的正确度验证方法为统计实验室参加室间质评活动的成绩，比较回报靶值和实验室检测结果，计算偏差及偏倚，绝对值后统计平均值平均偏倚《1/2，允许总误差（TEa）。

1.2.5临床可报告范围：选用高限值（H）和低限值样本（L），在已知线性区间内选择1个高浓度水平样本和一个低浓度水平样本，采用康润酶联免疫法检测，已知低浓度样本的检测结果为0.06ng/mL，高浓度样本的检测结果为15.77ng/mL，按低浓度样本与高浓度样本以5：0、4：1、3：2、2：3、1：4、0：5的比例进行稀释，稀释后的标本分别编号为1、2、3、4、5、6，每个浓度水平的样本重复测定2次，在1天之内完成。将2次测定结果取平均值并与稀释后的预期值相比较，采用线性回归分析，理论值为Y，理论值为已知高低值根据倍比稀释系数得出的数值，实测均值为X，均值为检测值1和检测值2的总和/2，得线性方程Y=aX+b。a为斜率，b为Y轴截距，R2为相关系数的平方，判断其是否线性。

1.3  统计学处理：采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计算精密度、多元方程、回归系数等，以P<0.05为差异有统计学意义。

2  结果

2.1 精密度

验证所得两个浓度水平批内CV%均小于厂家声明的10%，批间CV%均小于厂家声明的15%，表明该方法的精密度可达到要求。

2.2  正确度验证

2.3  根据预测值和实测均值绘制回归曲线见图1，R2=0.9957> 0.99，符合要求。

三、讨论

3.1 AMH 参与调节卵泡的生长与发育，对卵巢微环境产生影响，可用于评估女性生殖能力。AMH水平增高可反映非梗阻性无精子症患者睾丸内生殖细胞库的耗竭，是睾丸外分泌功能整体受损的标志3 。因此，检测AMH的方法显得尤为重要，本研究中，AMH分别应用康润和罗氏的AMH试剂盒进行检测，康润公司研发的AMH试剂盒采用酶联免疫法测定，罗氏公司研发的AMH试剂盒采用电化学发光法测定。，本研究旨在评估康润酶联免疫法检测AMH试剂盒的精密度、正确度、可报告范围、线性范围，是否与试剂说明书中性能质量结果相一致。

3.2结果显示AMH 低、高浓度时，批内精密度CV分别是2.64%和2.77%，批间精密度CV分别为7.8%和5.99%，电化学发光法的批内CV%为2.77%和2.60%;批间CV%为5.56%和7.0%，均小于判定标准，表明两种试剂盒方法的稳定性和重复性良好，精密度属于可接受范围。正确度验证偏倚均小于 1/ 2Tea，表明该试剂盒检测结果准确。

3.3 按照NCCLS的EP-6A文件评价AMH的分析测量范围，与罗氏电化学发光法进行样本一致性比对后，各自样本均落在各自的参考区间内，结果一致;线性评价中实测值与理论值相关性较好，根据预测值和实测均值绘制直线回归曲线，相关系数R2=0.9957> 0.99，验证在试剂盒线性区间内AMH在不同浓度时检测结果与理论值呈线性分布，符合要求。

综上所述，应用康润公司AMH检测试剂盒检测AMH，精密度高，正确度好，具有良好的线性测量范围，验证和评价标准符合，保证AMH检验结果的准确、可靠，可用于临床AMH血清样本的常规检测，值得推广应用。

参考文献

[1]Kimura A P，Yoneda R，Kurihara M，et al. A Long Noncoding RNA，lncRNA-Amhr2，Plays a Role in Amhr2 Gene Activation in Mouse Ovarian Granulosa Cells.[J].Endocrinology，2017，158（11）：4105-4121.

[2]梁琳琳，李杭生，张翠莲，卵巢功能评估现状研究[J].中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（3）：213-215.

[3]徐进，夏彦清，王晓芳，等.非梗阻性无精子症患者血清抗缪勒氏管激素水平与睾丸显微取精结果的关系[J].中华实用诊断与治疗杂志，2019，33（5）：480-482.