ANA、LKM-1、AMAM2、LC-1及SLA/LP联合检测在乙肝病毒感染分型中的应用研究

谢璟 陈建华 徐荣

[摘要] 目的 探討ANA、LKM-1、AMA M2、LC-1及SLA/LP联合检测在乙肝病毒感染分型中的应用研究。 方法 选取2015年1月～2019年5月我院传染科35例乙肝合并自身免疫性肝病患者作为观察组，同时选取65例乙肝病毒感染患者作为对照组。观察两组血清抗核抗体（ANA）、抗肝肾微粒体Ⅰ型抗体（LKM-1）、抗线粒体抗体（AMA M2）、抗肝胞浆Ⅰ型抗体（LC-1）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP）阳性率，对结果进行分析。 结果 观察组中ANA的阳性率（35.00%）高于对照组（21.86%），观察组中LKM-1、AMA M2、LC-1及SLA/LP的阳性率均显著高于对照组（P<0.05），差异均有统计学意义（P<0.05）。对照组ANA阳性主要为核颗粒型，主要在1：100的血清稀释度中检出，观察组ANA阳性主要为核均质性，主要在1：1000的血清稀释度中检出，两种核型稀释度组间差异有统计学意义（P<0.05）。 结论 多项自身抗体联合检测对乙肝及自身免疫性肝病的抗体检测全面，ANA检测是初筛试验，LKM-1、AMA M2、LC-1及SLA/LP等是确证试验，有助于临床诊断及指导用药。

[关键词] 抗核抗体;肝自身抗体;乙肝病毒感染;自身免疫性肝病

[中图分类号] R512.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）24-0021-03

[Abstract] Objective To investigate the application of combined detection of ANA， LKM-1， AMA M2， LC-1 and SLA/LP in typing of hepatitis B virus infection. Methods From January 2015 to May 2019， 35 patients with hepatitis B and autoimmune liver disease in the Department of Infectious Diseases of our hospital were selected as the observation group， and 65 patients with hepatitis B virus infection were selected as the control group. The positive rates of serum anti-nuclear antibody（ANA）， anti-liver and kidney microsome type I antibody（LKM-1）， anti-mitochondrial antibody（AMA M2）， anti-hepatic cytoplasmic type I antibody（LC-1）， and anti-soluble liver antigen/ liver-pancreas（SLA/LP） autoantibody of two groups were observed. The results were analyzed. Results The positive rate of ANA in the observation group（35.00%） was higher than that in the control group（21.86%）. The positive rates of LKM-1， AMA M2， LC-1 and SLA/LP in the observation group were significantly higher than those in the control group（P<0.05）， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The ANA positive in the control group was mainly nuclear particle type， mainly detected at 1：100 serum dilution， and the ANA positive in the observation group was mainly nuclear homogeneity， mainly detected at 1：1000 serum dilution. The difference in two karyotype dilutions between the groups was statistically significant（P<0.05）. Conclusion The combined detection of multiple autoantibodies for the detection of hepatitis B and autoimmune liver diseases is comprehensive. The ANA test is a preliminary screening test. LKM-1， AMA M2， LC-1 and SLA/LP are confirmatory tests， which are helpful for clinical diagnosis.  And guide medication.

[Key words] Antinuclear antibody; Liver autoantibody; Hepatitis B virus infection; Autoimmune liver disease

近些年来，我国各种肝炎的发病率呈逐年递增趋势，病毒性肝炎是在各种肝炎病毒对肝脏的侵害下患上的一种传染病，有甲型、乙型、丙型、丁型及戊型五种类型，以乙型和丙型常见[1，2]，其中还有部分患有自身免疫性肝病。在当前，对自身免疫性肝病的发病原因还不是很了解，但患者有食欲消减、精神疲乏、身体无力、恶心呕吐等临床表现，在B超及肝功能检测上发现肝脏增大和肝功能异常，一部分患者还有关节疼痛、上呼吸道感染等临床症状。对患者的身体健康安全和生活质量有严重影响。所以研究乙型肝炎患者的临床特征，并进一步地了解其免疫情况，及时给予对症治疗是非常必要的[3，4]。本文通过研究65例乙肝病毒感染患者和35例乙肝合并自身免疫性肝病患者的不同抗体的表现情况，探讨抗核抗体与肝自身抗体联合检测对乙肝感染分型应用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2015年1月～2019年5月65例乙肝病毒感染和35例乙肝合并自身免疫性肝病患者，均为医院传染科门诊和住院患者，前者设为对照组，男45例，女20例，年龄22～78岁，平均（45.23±6.49）岁;后者设为观察组，男24例，女11例，年龄24～75岁，平均（46.72±5.72）岁。两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

纳入标准：所有患者的ALT超过50 IU/L，AST超过50 IU/L，球蛋白超过30 g/L，对照组患者中相关抗原抗体指标为阳性，观察组及对照组中相关抗原抗体指标为阴性。对照组患者符合2001年颁布的病毒性肝炎防治方案中乙肝诊断标准。排除标准：患有原发性的心、肝、肾等器官疾病的患者;存在乙肝外其他病毒感染患者及其他肝脏疾病的患者;精神异常不能正常交流的患者。

1.3 方法

1.3.1 抗核抗体检测  所有研究对象于清晨空腹状态下抽取5 mL静脉血液，以3000 r/min的转速将血液中血清分离出来，将血清以1：100、1：320和1：1000的比例稀释，采用间接免疫荧光法检测血清抗核抗体（ANA），将Hep-2细胞和猴肝这两种基质作为抗原，按照试剂盒的使用说明书操作，试剂由北京和杰创新生物医学科技有限公司提供。具体步骤为：（1）待测血清用洗涤液作1：100稀释，并加入反应孔内;（2）将抗原片盖在倒扣板对应的凹槽里，确保样本与抗原基质接触，室温孵育30 min;（3）用洗涤液轻轻从一侧将反应液冲洗掉，浸泡至洗片缸内，静置5 min后，再用蒸馏水冲洗1次;（4）在倒扣板的反应孔内加入ANA荧光二抗，将抗原片盖在倒扣板对应的凹槽里，确保样本与抗原基质接触，室温孵育30 min;（5）再次洗涤蒸馏水冲洗，在盖玻片上滴加封片剂;（6）最后采用荧光显微镜观察结果，若血清稀释度≥1：100时细胞或组织出现黄绿色特异性荧光，则表明为阳性[5]，并对ANA阳性者作进一步的检测判断核型。

1.3.2 肝自身抗体检测  采用免疫印迹法检查4项组合的肝自身抗体，包括抗肝肾微粒体Ⅰ型抗体（LKM-1）、抗线粒体M2型（AMA M2）、抗肝溶质抗原Ⅰ型抗体（LC-1）、抗可溶性肝抗原/肝胰抗原抗体（SLA/LP），取稀释后的血清，按照说明书严格执行操作，检测中所使用的试剂为欧蒙公司生产，仪器为全自动免疫印迹儀，具体步骤为：（1）将待检血清和血浆标本用标本缓冲液1：101稀释;（2）将实验膜条放入温育槽中温育5 min，之后吸去温育槽中的液体;（3）在温育槽中分别加入1.5 mL已稀释血清于室温温育30 min;（4）吸去温育槽中的液体并在摇摆摇床上用1.5 mL清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min;（5）在温育槽中加入1.5 mL已稀释的酶结合物（碱性磷酸酶标记的抗人IgG），于室温温育30 min;（6）吸去温育槽中的液体并在摇摆摇床上用1.5 mL清洗缓冲液清洗膜条3次，每次5 min;（7）在温育槽中分别加入1.5 mL底物液， 于室温温育10 min;（8）吸去温育槽中的液体，用蒸馏水清洗膜条3次，每次1 min。观察着色带的着色强度判断相关抗体是否为阳性[6]。

1.4 观察指标

观察对照组和观察组的ANA、LKM-1、AMA M2、LC-1、SLA/LP的阳性率;不同稀释度血清的ANA检出情况及ANA者的核型情况[7]。

1.5 统计学处理

采用SPSS 22.0统计学软件分析。计数资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用t检验，计数资料以%表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组研究对象抗体阳性率比较

观察组中ANA的阳性率（35.00%）高于对照组（21.86%），差异具有统计学意义（P<0.05）。观察组中LKM-1、AMA M2、LC-1及SLA/LP的阳性率分别为20.00%、35.00%、10.00%及20.00%，对照组中LKM-1、LC-1及SLA/LP的阳性率为0，AMA M2的阳性率为6.51%，观察组各项阳性率显著高于对照组，差异均具有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组研究对象不同血清稀释度ANA比较

对照组中ANA阳性患者中核颗粒型有20例（42.55%），核均质性有14例（29.79%），主要以核颗粒型为主，两组核型主要在1：100的血清稀释度中检出，观察组中ANA阳性患者中核颗粒型有2例（28.57%），核均质性有5例（71.43%），主要以核均质型为主，两种核型主要在1：1000的血清稀释度中检出，组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3 讨论

据2017年9月统计结果显示，我国乙肝病毒携带者超过9000万人次，其中有2800万人次为慢性乙肝患者，每年大约有33万人次应为乙肝或丙肝引发的肝癌或肝硬化死亡[8]。根据2014年北京市乙肝新发的发病率表明10万人中有3例患病，比2013年有所下降，但仍能发现我国是乙肝大国[9]。根据相应的研究发现，自身抗体是机体在各种因素作用下，致使B淋巴细胞以自身组织为抗原产生相应抗体，对机体正常组织存在攻击性，使患者出现相应的生理、病理改变，表现出相应的症状，而乙肝病毒感染可加大机体免疫应答反应，刺激多种抗体产生，且抗体的种类与数量和疾病严重程度有关[10，11]。当今对乙肝患者和AIH患者分别应用干扰素和免疫抑制剂治疗，干扰素以促进T淋巴细胞生成达到抗病毒目的，而免疫抑制剂抑制B细胞或T细胞增殖达到降低免疫反应目的，两种药物的药理相反，若给予相反的药物会加重疾病病情[12，13]，所以，自身抗体检测对肝炎患者是很重要的。