Bt蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah对玉米蚜的效应评价

孙丹丹， 陈 瑜， 王月琴， 王振营， 何康来

中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193

1996 年转基因玉米在美国开始商业化种植，随后转基因作物在全球的种植范围迅速扩展，转Bt基因玉米是目前生产发展最快的转基因抗虫作物之一。转Bt基因玉米通过持续表达外源Bt蛋白，在整个生育期都可以对靶标害虫产生防治效果，目前商业化应用中，以Cry和Vip抗虫蛋白居多(ISAAA,2018)。如欧洲唯一法定可种植抗虫玉米是MON810，表达Cry1Ab Bt杀虫蛋白(EFSA Panel on Genetically Modified Organisms,2010)。转Bt基因玉米种植可区域性地降低害虫种群密度(Dively,2018)，经济效益明显，同时对非靶标生物，尤其是昆虫天敌及非靶标害虫等存在潜在生态风险，主要体现在两方面(叶恭银等, 2011)：一是Bt作物可能直接对Bt蛋白不敏感的其他节肢动物害虫产生影响，如棉蚜Aphisgossypii(Glover)、盲蝽蟓、烟蓟马Thripstabaci(Lindeman)等(Kumaretal.,2014; Luetal.,2010; Zhangetal.,2012)； 二是可能影响自然生态系统的服务功能，如对生物防治、动物传粉和废弃物分解等的影响(Zeilingeretal.,2016)。

玉米蚜Rhopalosiphummaidis(Fitch)广泛存在于多种农田生态系统中，是影响玉米生产的重要害虫之一。它除了刺吸植物组织汁液，还传播植物病毒，进而造成更为严重的间接危害和产量损失(Anwayetal.,2005)。在农田生态系统中，玉米蚜既是捕食性天敌昆虫、寄生性天敌昆虫，也是其他节肢动物的食物来源。这表现为两方面：一方面其虫体本身是草蛉、食蚜蝇和瓢虫等昆虫主要甚至是专一的食物(Romeis & Meissle,2011)，另一方面其排泄物(蜜露)是一些节肢动物的重要能量来源(Zhangetal.,2012)。当其种群严重波动时，将会对与其相关的整条食物链造成扰动，进而影响农田生态系统的平衡。因此，玉米蚜虫是用于转基因作物环境风险评价的重要指示性生物(任少鹏等,2018)。有关蚜虫取食转基因抗虫玉米引起的食物网中非靶标天敌昆虫等直接或间接暴露于Bt蛋白的安全风险已有很多研究报道，总的结论是没有显著影响(刘慧等,2012; Digilioetal.,2012; Duanetal.,2010; Lietal.,2008; Löveietal.,2009; Romeisetal.,2014; Tianetal.,2014)。转基因玉米植株活体生测研究对蚜虫的影响不尽一致。研究表明，表达Cry1Ab蛋白的转基因玉米(Bt11, MON810和Event 176)比其非转基因对照近等杂交种更感玉米蚜(Bourguetetal.,2002; Duttonetal.,2002; Fariaetal.,2007; Lumbierresetal.,2004; Ponsetal.,2005);另有研究表明，表达Cry1Ab转基因抗虫玉米对麦长管蚜Sitobionavenae(Fabricius)的生长发育和繁殖没有影响(Ramirez-romeroetal.,2008)。此外，一些Bt杀虫蛋白对蚜虫有低水平的毒力(Porcaretal.,2009; Walters & English,1995; Waltersetal.,1994)。

本研究采用饲料添加法及自制的生测装置，研究国产转基因抗虫玉米表达的3种Bt杀虫蛋白Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah对玉米蚜的生长发育及存活、有翅蚜率等的影响，以期为农田生态系统中转基因玉米的环境安全评价提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试蚜虫

玉米蚜种群采自中国农业科学院植物保护研究所廊坊科研中试基地玉米田，室内用大麦在人工培养箱(宁波江南RXZ-500D-LED)中饲养数代后备用。培养箱内环境条件：温度(22±1)℃，相对湿度60%±5%，光周期16L∶8D。玉米蚜1日龄若蚜用于实验。

1.2 供试蛋白及试剂

本实验所用的Vip3Aa19、Cry1Ab蛋白由北京大北农生物技术有限公司提供，Cry1Ah蛋白由北京奥瑞金种业股份有限公司提供。酪蛋白(casein，CS)，购于碧迪医疗器械(上海)有限公司。PBS缓冲液(1×PBS Buffer)为北京酷来搏科技有限公司生产，pH 7.2～7.4。印楝素(C35H44O16, neem oil)为内蒙古清源保生物科技有限公司生产，含量3.0%。其他常见试剂皆为分析纯。通过饲料混合生测法(Heetal.,2005; Yangetal.,2018)分别明确了实验用Vip3Aa19杀虫蛋白对靶标害虫黏虫Mythimnaseparata(Walker)、Cry1Ab和Cry1Ah杀虫蛋白对靶标害虫亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée) 的毒力，致死中浓度LC50分别为1.64、0.10、0.40 μg·g-1，表明供试的3种Bt蛋白对其相应的靶标害虫都具有很高的杀虫活性。

1.3 实验设计

玉米蚜取食生测方法采用全纯人工饲料添加法，即在玉米蚜的全纯人工饲料中分别添加测试的Bt蛋白。每天观察记录蚜虫的蜕皮、死亡及产蚜情况，直至蚜虫死亡，每天去除母蚜所产若蚜。玉米蚜的全纯人工饲料由本实验制备，饲料配方参考Kieckhefer & Derr(1967)，其中含有23种氨基酸，总浓度为21.575 mg·mL-1。饲料制备在实验前5～7 d完成，饲料制备完成后分装放置-20 ℃保存。

玉米蚜取食生测分别进行3组实验。每组实验5个处理：(1)抗虫蛋白实验组，向全纯人工饲料中添加供试Bt蛋白，分别为PBS缓冲液溶解的Vip3Aa19蛋白溶液(终浓度31.2 μg·mL-1)、Na2CO3溶液溶解的Cry1Ab蛋白溶液(终浓度15.8 μg·mL-1)或Na2CO3溶液溶解的Cry1Ah蛋白溶液(终浓度15.7 μg·mL-1)；(2)中性对照组，分别为PBS缓冲液溶解的CS溶液或Na2CO3溶液溶解的CS溶液，CS浓度与其对应的Bt蛋白实验浓度相同；(3)阴性对照组，PBS缓冲液或者Na2CO3溶液；(4)低浓度阳性对照(Neem-L)，3.0%的Neem稀释1000倍的溶液；(5)高浓度阳性对照(Neem-H)，3.0%的Neem稀释200倍的溶液。玉米蚜生测实验中添加的Vip3Aa19、Cry1Ab和Cry1Ah的浓度分别是引起靶标害虫半致死浓度的19、166、39倍。每个处理6次重复，每次重复测试30头蚜虫。

蚜虫取食装置结构参考Mittler & Dadd(1964)的三明治膜取食器制作而成，即高30 mm、直径10 mm，两端开口的玻璃管，一端用不锈钢纱网封口，另一端用双层封口膜夹饲料滴(0.1 mL)做成供食室。在每个处理的全纯人工饲料取食器中，接入玉米蚜1日龄若蚜30头。将蚜虫连同取食器放置在人工培养箱内饲养观察(培养箱内环境条件同1.1)，第8天换饲料1次，每天观察并记录生长发育和死亡蚜虫数、新产若蚜数和有翅蚜数。

1.4 数据统计分析

根据各处理每天存活蚜虫数、有翅蚜数、产子代蚜日期、产蚜数等分别计算存活率等生物学参数。种群生存曲线采用逻辑斯蒂模型分析，统计计算采用PoloPlus软件，得到半数生存时间ST50、回归系数、卡方值、异质因子。不同处理的ST50之间差异性比较根据其置信区间是否重叠判断。取食不同处理饲料各虫态玉米蚜的发育历期(若虫期、成虫期、繁殖期)、存活率、有翅蚜率及产蚜量的变异采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，使用GraphPad Prism 5软件进行统计计算。

2 结果与分析

2.1 3种Bt蛋白处理下玉米蚜的存活率

Neem-L和Neem-H处理全纯人工饲料饲养玉米蚜，分别在取食1和2 d出现显著死亡，取食2和4 d时死亡率接近50%，取食4和7 d时全部死亡，且没有繁殖下一代若蚜；而取食分别添加了Vip3Aa19、Cry1Ab、Cry1Ah、CS、PBS、Na2CO3的全纯人工饲料的玉米蚜，在取食5 d时开始繁殖下一代若蚜，6～7 d时出现显著死亡，最长可存活14 d以上(图1)。

Neem-H处理因在取食4 d时全部死亡，没有足够的数据点进行曲线拟合计算，其余取食不同饲料处理的蚜虫生存时间符合逻辑斯蒂曲线模型(表1)。取食添加了Vip3Aa19、CS、PBS的全纯人工饲料的玉米蚜，其50%个体生存时间为8.3～8.6 d，不同处理间差异不显著，各处理种群生存趋势(回归系数)间差异不显著(表1)。与之相比，Neem-L处理50%个体生存时间为3.2 d，显著低于其他处理，且种群生存趋势(回归系数显著小)下降显著。

取食添加了Cry1Ab、CS、Na2CO3的全纯人工饲料的玉米蚜，其50%个体生存时间为9.0～9.6 d，不同处理间差异显著。Cry1Ab蛋白处理的生存时间显著长于Na2CO3处理，而CS处理与Cry1Ab蛋白或Na2CO3处理间差异均不显著(表1)。与之相比，Neem-L处理50%个体生存时间为4.0 d，显著降低。Cry1Ab、CS、Na2CO3处理种群生存趋势(回归系数)间差异不显著，但显著大于Neem-L处理。

取食添加了Cry1Ah、CS、Na2CO3的全纯人工饲料的玉米蚜，其50%个体生存时间为8.3～8.5 d，不同处理间差异不显著(表1)。与之相比， Neem-L处理50%个体生存时间为4.0 d，显著降低。Cry1Ah、CS、Na2CO3处理种群生存趋势(回归系数)间差异不显著，但显著大于Neem-L处理。

2.2 3种Bt蛋白处理下玉米蚜的发育历期

不同处理间，玉米蚜若蚜期、繁殖期及成蚜期存在显著差异(表2)。与取食添加PBS饲料处理相比，取食Vip3Aa19或CS蛋白饲料处理的若蚜发育历期显著缩短，成蚜期显著增长，繁殖期显著增长(Vip3Aa19处理)。而Vip3Aa19与CS蛋白饲料处理的若蚜期、繁殖期和成蚜期之间差异不显著。取食添加Cry1Ab和CS蛋白饲料2个处理间的若蚜发育历期、繁殖期和成蚜期差异均不显著。与之相比，取食添加PBS或Na2CO3饲料处理的若蚜发育历期显著增长，繁殖期和成蚜期则显著缩短。取食添加Cry1Ah和CS蛋白饲料2个处理间的若蚜发育历期、繁殖期和成蚜期差异均不显著。而取食添加Na2CO3比添加CS饲料处理的若蚜发育历期显著增长，成蚜期则显著缩短。

图1 玉米蚜取食分别添加3种Bt蛋白全纯人工饲料的生存曲线Fig.1 Survival model of corn leaf aphids fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

表1 玉米蚜取食分别添加3种Bt蛋白全纯人工饲料的生存时间Table 1 Survival time of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

2.3 3种Bt蛋白处理下玉米蚜的有翅率及产蚜量

玉米蚜取食添加Vip3Aa19与CS蛋白处理间相比，其有翅蚜率及产蚜量均无显著性差异，但均显著高于取食添加PBS处理(表3)。说明添加Vip3Aa19和CS比PBS利于玉米蚜繁殖。取食添加Cry1Ab与CS蛋白处理间相比，其产蚜量差异不显著，但均显著高于添加Na2CO3处理。而取食添加Cry1Ab和PBS处理的有翅蚜率间无显著差异，但均显著低于添加CS蛋白处理。取食添加Cry1Ab、CS蛋白及Na2CO3处理间相比，有翅蚜率差异不显著，仅Na2CO3处理的产蚜量显著低于前二者。

表2 玉米蚜取食分别添加3种Bt蛋白全纯人工饲料的发育历期Table 2 Developmental time of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

表3 玉米蚜取食分别添加3种Bt蛋白 全纯人工饲料的有翅率及产蚜量Table 3 Percentage of alatae and reproduction of corn leaf aphid fed on pure artificial diet incorporated with each of 3 Bt proteins

3 讨论

饲料添加法测定某一物质(化学杀虫剂、Bt蛋白等)对昆虫尤其是天敌的影响被广泛采用(Romeisetal.,2008)，以甄别供测试物质对测试对象(多为天敌)是否存在“毒力”活性，因此设置已知具有毒力活性物质的阳性对照和溶解所测试物质(如Bt蛋白)溶剂或缓冲液为阴性对照(Lietal.,2008； Porcaretal.,2009; Walters & English,1995)，验证生测体系能够灵敏的检测出处理间真实存在的显著差异。本研究表明，不同浓度处理引起蚜虫死亡率间存在显著差异。说明这一生测体系能够真实检测出不同供试物质处理间毒力活性差异。

有研究报道，马铃薯蚜Macrosiphumeuphorbiae(Thomas)对Cry2、Cry3A和Cry4晶体悬浮液敏感，而对其溶液不敏感(Walters & English,1995; Waltersetal.,1994),这可能与晶体的非完全溶解和生测时对照没有添加溶解晶体的缓冲液有关(Walters & English,1995)。Porcaretal.(2009)研究报道了豌豆蚜Acyrthosiphonpisum(Harris)对Cry3A、Cry4Aa、Cry11Aa和Cyt1Aa有低水平的敏感性，且必须是以溶解这些Bt蛋白的缓冲液为对照进行比较。本研究结果表明，与阴性对照相比，饲料中分别添加3种Bt蛋白有利于玉米蚜的生长发育和繁殖。此外，考虑到生测用玉米蚜全纯人工饲料，其营养成分含量一定，而测试的Bt蛋白为蛋白质，除考虑其杀虫活性之外，还应考虑其营养成分属性，饲料中添加或提高饲料的营养质量。因此，本实验中增加了等量的CS为中性对照。而全纯人工饲料中分别添加3种Bt蛋白处理的玉米蚜存活率和生存时间、若蚜期、繁殖期和成蚜期以及产蚜量与添加CS蛋白处理没有显著差异，而与阴性对照相比差异显著。说明玉米蚜全纯人工饲料中分别添加3种Bt蛋白或CS蛋白，起到了相同的作用，即提高了饲料营养质量。由于转基因作物表达的Bt蛋白在韧皮部组织汁液中检测不到或含量极低(Duttonetal.,2002; Rapsetal.,2001)。实际生产中转基因玉米表达的Bt蛋白量远达不到本实验中的浓度，因此，这种有益于玉米蚜生长发育的现象在实际中并不一定能体现。虽有研究报道，6个表达BtCry1Ab转基因玉米中的5个比其常规对照玉米上玉米蚜种群数量增加，且与Bt玉米韧皮部组织汁液的氨基酸表达量高相关(Fariaetal.,2007)，但不能完全排除是由品种间差异引起。

生态系统中，蚜虫以刺吸式口器刺入植物韧皮部吸食组织汁液，与土壤芽孢杆菌Bt的生态位差异较大。因此，基本不存在相互协同进化的可能。Kieckhefer & Derr (1967)曾指出，适宜蚜虫存活和繁殖的全纯人工饲料其蔗糖含量应为10%～30%，最适为20%。虽然Porcaretal. (2009) 报道了Cry3A、Cry4Aa、Cry11Aa和Cyt1Aa等Bt蛋白对豌豆蚜有低水平的毒力活性，然而其使用浓度都非常高，在125～500 μg·mL-1浓度下才能观测到低水平的影响，实验虽然设置了缓冲液作为阴性对照，但缺乏中性蛋白对照。同时，其生测方法亦是添加Bt蛋白到全纯人工饲料，即营养成分有一定的均衡性，大量增加单一Bt蛋白的合理性，是否会对饲料营养适宜性及蚜虫取食消化产生不利影响有待商榷。本研究中以添加CS蛋白作为中性对照，测试浓度是Porcaretal.(2009)测试浓度的3%～25%，饲料的氮含量提高了0.7%～1.4%，无论是Bt蛋白还是CS蛋白都有利于玉米蚜的生长发育和繁殖，即实质等同性，可解释为Bt蛋白和CS蛋白一定程度上提高了全纯人工饲料的营养质量,但最高可添加量有待于进一步研究探讨。