ApNPV侵染对柞蚕幼虫生长和血淋巴营养物质含量的影响

于庭洪 贾 姝 宋 策 赫英姿 赵 翀 左玲玲

(辽宁省蚕业科学研究所，辽宁凤城 118100)

柞蚕(Antheraeapernyi)为鳞翅目(Lepidoptera)、大蚕蛾科(Saturniidae)、柞蚕属(Antheraea)的一种大型泌丝、食用及工业原料昆虫[1-2]，是我国重要的经济昆虫资源之一。柞蚕核型多角体病毒病又称柞蚕脓病，是由柞蚕核型多角体病毒(Antheraeapernyinucleopolyhedrovirus，ApNPV)感染引起的柞蚕主要病害之一，其侵染蔓延剧烈，发生广泛，对柞蚕危害严重。世界上饲养柞蚕的国家都有发生，我国辽宁、吉林、黑龙江、内蒙古、山东、河南等各蚕区普遍发生，辽宁省一般发病年份发病在10%～20%，严重时达50%以上[3]。目前，有学者已对ApNPV生物学特性[4]、毒力[5]、感染规律[6]等进行了较为深入的研究，对ApNPV的分子生物学研究也进展迅速，已完成该病毒的全基因组测序及部分重要基因的功能研究[7-12]，这些研究成果对于建立病害防治的新策略具有重要意义。通过研究核型多角体病毒侵染对柞蚕4龄幼虫保护酶活性的影响[13]，检测过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性在接种后的变化趋势，确定其对柞蚕生长发育和血淋巴营养物质的影响，有助于从生理生化角度揭示核型多角体病毒对柞蚕的致病机理，还可以为进一步弄清柞蚕与病原微生物之间的拮抗关系提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试柞蚕品种为抗大。将孵化后的柞蚕幼虫在室内温度24 ℃、相对湿度75%环境下以麻栎叶饲养至4龄第3天，用于病毒添食处理。

供试核型多角体病毒：由本所柞蚕病害防治课题组保存。

1.2 ApNPV纯化和幼虫感染

取保存的感病柞蚕幼虫，使用体积分数为75%乙醇进行体表消毒后加灭菌水充分研磨。将研磨液转移至离心管中，500 r/min离心1 min，取上清液；4℃条件下3000 r/min离心5 min，弃上清，用无菌水悬浮沉淀，以上操作重复3次，离心后弃上清，沉淀加适量无菌水配制成浓度为2×109PIB/mL的多角体悬浮液备用。

取柞蚕4龄第3天幼虫70头，将ApNPV多角体按照1×107个/头(约5 μL病毒多角体悬液)的剂量，用微量进样器经口直接接种供试幼虫，幼虫接种病毒后继续在室内(24 ℃ )饲养。

1.3 ApNPV侵染对幼虫生长的影响

取处理组和对照组柞蚕各30头(共3组，10头/组)。每隔24 h调查柞蚕的体重、给叶量、残叶量，记录数据并用SPSS19.0数据统计分析软件进行分析。

摄食量(g)=饲养期间给叶量(g)-残留叶量(g)

1.4 ApNPV侵染对幼虫血淋巴营养物质含量的影响

处理后每隔 24 h，取病毒接种处理组及正常对照组幼虫各5头，剪破第3腹足混合取血淋巴作为待测样品，置于液氮中迅速冷冻后移入20 ℃冰箱中保存备用。

1.4.1 被侵染幼虫血淋巴总糖含量的测定

参照肖猛[14]的方法制备无蛋白溶液。然后用蒽酮比色法[15]测定柞蚕幼虫血淋巴总糖含量，每个处理重复3次。血淋巴中总糖的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.2 被侵染幼虫血淋巴海藻糖含量的测定

参照文献[16]的方法，以海藻糖标准品制作标准曲线。取1 mL稀释后的待测样品加入0.15 mol/L浓硫酸0.2 mL，摇匀后沸水浴加热5 min，冷却后再加入30% KOH溶液0.2 mL，摇匀后沸水浴加热5 min，再冷却后加入4 mL蒽酮试剂，摇匀后沸水浴加热5 min，待冷却后用紫外分光光度计在620 nm处测定OD值。每个处理重复3次。血淋巴中海藻糖的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.3 被侵染幼虫血淋巴蛋白质含量的测定

采用考马斯亮蓝G-250染色法测定[17]。每个处理重复3次。血淋巴中蛋白质的含量，以mg·mL-1表示。

1.4.4 被侵染幼虫血淋巴酯酶活性的测定

参照陈长琨的方法[18]，稍有改动。在5 mL含3×10-4mol/L的α-醋酸萘脂的磷酸缓冲液(pH=7.0)中加入稀释一定倍数的血淋巴1 mL摇匀，置25 ℃温浴中30 min，立即加入1 mL显色液，室温下30 min待出现稳定的蓝绿色，测得OD600值，重复3次。根据标准曲线计算出血淋巴酯酶的活力大小。

2 结果与分析

2.1 感染ApNPV后柞蚕幼虫生长发育的变化

采用Microsoft Excel和SPSS19.0软件对实验数据进行统计分析，对同一时间不同处理的差异进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较。经ApNPV处理后幼虫的摄食量变化如表1所示，添毒后1～3 d，处理组与对照组的柞蚕幼虫摄食量均有所提高，不同处理间差异不明显(P>0.05)；随后对照组幼虫摄食量有所下降，而处理组幼虫摄食量从第4天起开始下降，第6天与对照组达到显著水平(P<0.05)，第7、第8天达到极显著水平(P<0.01)。经ApNPV处理后幼虫的体重变化如表2所示，对照组幼虫体重呈现持续上升趋势；处理组添毒后1～6 d，幼虫体重逐渐升高，但始终低于对照，与对照组差异不显著(P>0.05)；第7天，幼虫体重开始呈负增长，与对照组差异显著(P<0.05)；到第8天，处理组幼虫体重极显著低于对照组(P<0.01)。

表1 ApNPV侵染对柞蚕幼虫摄食量的影响

表2 ApNPV侵染对柞蚕幼虫体重的影响

2.2 感染ApNPV后柞蚕幼虫血淋巴总糖含量的变化

ApNPV侵染后柞蚕血淋巴总糖含量变化如图1所示。处理组和对照组的血淋巴总糖含量均先升高后降低。处理后1 d，添毒幼虫血淋巴总糖含量极显著低于对照组(P<0.01)，第2天，处理组总糖含量显著升高达到峰值(9 mg/mL)，略高于对照组但并未达到显著水平(P>0.05)；随后，对照组继续升高，在第3天达到最大值(8.711 mg/mL)后开始下降，处理组总糖含量开始逐渐下降，并极显著低于对照组(P<0.01)。

2.3 感染ApNPV后柞蚕幼虫血淋巴海藻糖含量的变化

ApNPV侵染后柞蚕血淋巴海藻糖含量变化如图2所示。添毒后第1天，处理组与对照组海藻糖含量相差不大，未达到显著水平(P>0.05)；第2至第8天，两组海藻糖含量均呈现“升高—降低—升高”的趋势，但处理组海藻糖含量总体均极显著低于对照组(P<0.01)。

2.4 感染ApNPV后柞蚕幼虫血淋巴蛋白质含量的变化

ApNPV侵染后柞蚕血淋巴蛋白质含量变化如图3所示。添毒处理后，柞蚕幼虫血淋巴蛋白质含量逐渐升高到第7天达到峰值(68.32 mg/mL)，随后略有下降；对照组第1至第5天，变化较平缓，第6天有所上升到第7天达到峰值(47.22 mg/mL)后下降。第1至第3天，两组差异不显著，3 d后处理组幼虫蛋白质含量显著升高，并明显高于对照组(P<0.01)。

2.5 感染ApNPV后柞蚕幼虫血淋巴酯酶活性的变化

ApNPV侵染后柞蚕血淋巴酯酶活性变化如图4所示。处理组和对照组血淋巴酯酶活性均升高，分别在第7天达到最大值(处理组9.95×10-4mol/L、对照组7.54×10-4mol/L)，随后略有下降；添毒后第1天，幼虫的酯酶活性显著低于对照组(P<0.05)，随后处理组酯酶活性显著升高，第2至第6天与对照组无明显差异(P>0.05)；4 d后高于对照组，到第7、第8天，处理组酯酶活性极显著高于对照组(P<0.01)。

3 讨 论

核型多角体病毒侵染扰乱了柞蚕幼虫正常的生长发育，表现为摄食量异常、生长发育缓慢甚至出现负增长。体重是反映动物营养状态的重要指标，其稳定性依赖于能量摄入和能量消耗之间的平衡[19]。对照组柞蚕的体重持续升高，表明幼虫能量摄入量高于消耗量，使其能量积累体重升高；而处理组在添毒初期，柞蚕幼虫的摄食量增长并且高于健康柞蚕，柞蚕体重升高，但仍低于对照；添毒后5～8 d，添毒幼虫的摄食量显著较少，其体重也增长缓慢，始终低于对照，第7、第8天，添毒幼虫体重开始呈负增长，与对照组差异显著。说明ApNPV侵染刺激了柞蚕的消化系统，使其摄食量上升，体重增加，但随着ApNPV在蚕体内的增殖，柞蚕体内正常的生长发育被扰乱，使其摄食量减少，能量摄入减少，体重下降。

ApNPV侵染对柞蚕血淋巴营养物质含量也有明显影响。病毒侵染初期，柞蚕血淋巴总糖含量升高，在第2天达到峰值，略高于对照组，随后开始下降并且显著低于对照组；添毒幼虫海藻糖含量显著低于健康幼虫；蛋白质含量显著升高；酯酶活性升高。昆虫血淋巴中含有昆虫生理活动所必需的一切物质及代谢产物。糖类是昆虫血淋巴的重要组分，是血淋巴贮存和运输能源物质的的重要形式，其中海藻糖是柞蚕的血糖，蚕体主要以海藻糖形式向各组织输送糖类以满足各组织的代谢需要[1]。ApNPV侵染初期，柞蚕受到外源物刺激，需要更多能量抵御外源物入侵，糖类合成加速，使总糖含量小幅度升高，但随着病毒核酸的复制、蛋白质的合成以及柞蚕防御系统的启动都需要大量的能量，造成柞蚕血淋巴总糖和海藻糖含量显著下降。处理组柞蚕血淋巴蛋白质含量的升高可能由于病毒的侵染刺激宿主防御系统发挥作用，血淋巴中产生更多的与免疫机制相关的酶类[20]，或者是由于柞蚕各组织器官功能受阻，对食物消化吸收功能减弱，血淋巴中的蛋白质分解转运受到抑制，而滞留在血淋巴中。感病柞蚕酯酶活性升高说明其分解脂类的能力增强，而脂类贮藏于脂肪体，所以酯酶活性增强破坏了脂肪体结构，导致昆虫组织解离，加速昆虫死亡。

综上所述，从柞蚕幼虫生长发育和血淋巴营养物质等指标的变化可以看出，外源微生物的入侵与增殖必然会扰乱柞蚕正常的生理调节、发育和代谢功能等，从而导致蚕患病直至死亡。深入研究病原微生物对柞蚕各项生理生化指标的影响，有助于进一步阐明其致病机理，并为弄清寄主与病原物之间的关系提供重要信息。