牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

（甘肃省民勤县畜牧兽医工作站，甘肃民勤 733000）

巴贝斯虫病（babesiosis），又名蜱热和德克萨斯热，硬蜱是其传播媒介，是一种危害家畜健康的重要血液原虫病之一，主要引起发病牛高热、贫血、黄疸、可视黏膜出血，后期多出现血红蛋白尿，严重时导致病畜死亡[1]。该病广泛流行于世界各地，全球年防控经费高达30亿美元[2]。目前我国已报道的牛巴贝斯虫病有6种，涉及的病原有牛巴贝斯虫（B.bovis）、双芽巴贝斯虫（B.bigemina）、大巴贝斯虫（B.major）、卵形巴贝斯虫（B.ovata）、巴贝斯虫未定种（B.U.sp.Kashi）[3]，以及由刘钟灵等发现感染水牛的东方巴贝斯虫（B.orientalis）[4]。不同的巴贝斯虫种引起的巴贝斯虫病的分布范围不尽相同，但主要流行于媒介蜱分布的热带、亚热带和温带地区，呈世界性分布，各大洲都有发生。我国各省份都有该病发生和分布的报道，如西藏、河北、河南、福建、云南、贵州、安徽、湖北、甘肃、广东、广西、江苏、陕西等省份都有牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的报道；大巴贝斯虫主要分布于新疆；卵形巴贝斯虫分布在河南、辽宁、甘肃、四川、贵州和吉林等省份[5]。其中牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫致病性最强，拥有相同的传播媒介——微小牛蜱[6]。

牛巴贝斯虫的传统鉴定方法主要是在实验室条件下借助显微镜进行虫体的形态学观察[7]。由于同属病原的形态相似，在涂片制作、染色过程中容易造成鉴定虫体变形，有时很难区分虫体的属和分离株。以酶联免疫吸附试验（ELISA）为代表的血清学检测方法只能对家畜血清抗体进行检测，不能反映宿主的实时感染现状，也不适用于在媒介蜱体内进行巴贝斯虫感染情况的流行病学调查和检测[8]。以聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）[9-15]为代表的分子生物学检测方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，尤其是实时荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）可实现快速检测，为巴贝斯虫病的分类鉴别提供了新思路。

本试验以巴贝斯虫Rap-1a基因为靶基因，建立牛巴贝斯虫的TaqMan荧光定量PCR检测方法。该方法具有敏感、特异、快速、简便等特点，适用于牛巴贝斯虫的诊断，可为该病流行病学调查提供快速有效的检测方法。

1 材料与方法

1.1 试剂和菌株及主要仪器

Premix ExTaqTM、ROX Reference Dye Ⅱ（50×）、PremixTaq™预混酶、大肠杆菌感受态细胞（DH5α），均购自TaKaRa公司；DNA提取试剂盒购，购自QIAGEN公司；ZymocleanGel DNA Recovery Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京全式金生物技术有限公司；质粒提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；pGEM-T Easy载体，为Promega公司产品；Stratagene Mx 3005P荧光定量PCR仪，为美国Stratagene公司产品；NanoDrop 2000/200C超微量分光光度计，购自美国Thermo Scietific公司。

1.2 基因组

牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛无浆体阳性基因组，以及健康牛阴性对照基因组，均由中国农业科学院兰州兽医研究所外寄生虫与虫媒疫病团队实验室制备和保存。

1.3 引物和探针的设计与合成

根据GenBank中牛巴贝斯虫Rap-1a基因的核苷酸序列（KT312814），用Primer Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计TaqMan荧光定量PCR引物。上游引物B.bo-rap-1F：5'-GTTCCTTAGGGAGGTTCCTCATGCT-3'；下游引物B.bo-rap-1R：5'-AGTCGTTAGCCTGAGTGGTATTTTC-3'；探针Bbo-rap-rtPb：5'-AACATTGCTCAACCTGCCAAG-3'，探针5'标记FAM荧光集团，3'标记BHQ1淬灭荧光集团。引物和探针均由西安擎科生物技术有限公司合成。

1.4 常规PCR扩增

PCR反应为25 μL体系：PremixTaq™预混酶（2×）12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件经优化为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃再延伸10 min，4 ℃保存。反应结束后，PCR产物进行15 g/L琼脂糖凝胶电泳分析（含Goldview I 型核酸染色剂，8 μL/100 mL），观察扩增结果。

1.5 标准品重组质粒制备

将普通PCR扩增条带进行胶回收，所得目的片段与pGEM-T Easy载体连接，连接体系为2×T4 DNA连接缓冲液5 μL、目的片段3 μL、载体1 μL、T4 DNA连接酶1 μL，共10 μL。将连接产物转化到大肠杆菌Trans DH5α感受态细胞中，用含氨苄青霉素的LB平板筛选阳性菌落，将PCR鉴定为阳性的重组质粒送西安擎科生物技术有限公司进行测序。参考文献[16]制备标准质粒，使用EASY Dilution质粒稀释液将构建的阳性质粒标准品进行十倍比稀释，-20 ℃保存备用。

1.6 实时荧光定量PCR反应条件优化

应用矩阵法对实时荧光定量PCR的上下游引物浓度、探针浓度、退火反应温度等条件进行优化。反应为25 μL体系，含Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）分别为0.2、0.5、0.8、1.0 μL，探针（10 μmol/L）分别为0.5、1.0 μL，水补齐至25 μL。退火温度分别为54、56、58、60 ℃选择，以得到最佳的反应条件。

1.7 实时荧光定量PCR标准曲线建立

将终浓度为1.0×108～1.0×101copies/μL的阳性质粒标准品作为模板，每个浓度重复3次，进行TaqMan实时荧光PCR扩增，由仪器自动生成标准曲线及扩增方程式。

1.8 敏感性试验

将终浓度为1.0×108～1.0×102copies/μL的阳性质粒标准品作为模板，每个浓度重复3次，进行敏感性试验，同时进行普通PCR扩增，比较其灵敏度。

1.9 特异性试验

以双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、牛无浆体、健康牛基因组（阴性对照）为模板进行TaqMan实时荧光PCR扩增特异性试验，同时设牛巴贝斯虫基因组阳性对照和空白对照。

1.10 稳定性试验

取浓度为1.0×108～1.0×102copies/μL的阳性质粒标准品作为模板分别进行组内和组间的实时荧光PCR扩增，每个稀释度重复3次。根据循环阈值（Ct）的差异计算组内、组间变异系数（CV）。

1.11 应用性检测

随机抽取本实验室采集保存的37份田间DNA样品，用建立的TaqMan实时荧光定量PCR进行检测，以评价该方法的实用性。

2 结果

2.1 标准品重组质粒制备及浓度检测

经PCR扩增，得到284 bp的目的基因片段Bo-Rap-1a（图1）。与pGEM-T Easy载体连接后转化至大肠杆菌Trans DH5α感受态细胞。PCR鉴定为阳性的重组质粒经测序正确后，使用NanoDrop 2000/200C超微量分光光度计测定阳性质粒浓度，配制终浓度为1.0×109copies/μL的质粒备用。

图1 目的基因片段PCR扩增结果

2.2 标准曲线绘制

经过对TaqMan荧光定量PCR的上下游引物浓度、探针浓度、退火反应温度等条件进行优化，循环阈值（Ct）最低的25 μL反应体系为Premix ExTaqTM（2×）12.5 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×）0.5 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，探针（10 μmol/L）1 μL，水补齐至25 μL。反应条件为：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。在每一循环的延伸温度结束时设定荧光信号采集点进行实时检测。用该体系对1.0×108～1.0×101copies/μL标准品质粒模板进行实时定量PCR扩增，反应结束后系统自动生成扩增标准曲线（图2），方程为y=-3.362×Log（X）+43.32，相关系数R2=0.999，扩增效率为98.4%，表明线性良好，符合定量要求。

图2 Real-time PCR标准曲线

2.3 牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR的灵敏度、特异性与稳定性检测

灵敏度检测中，对1.0×108～1.0×101copies/μL的标准品质粒模板平行扩增后，当模板浓度低至1.0×101copies/μL时，荧光信号达到了检测阈值（图3），为了获取更为清晰的扩增曲线，本方法的灵敏度设定为1.0×102copies/μL。普通PCR的灵敏度为1.0×104copies/μL（图4）。特异性检测中，仅牛巴贝斯虫出现扩增曲线（图5）。稳定性检测中，标准模板在1.0×108～1.0×103copies/μL时，组内和组间变异系数值均小于2.5%（表1），表明该方法具有良好的稳定性。

图3 牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR敏感性检测结果

图4 常规PCR敏感性检测结果

图5 牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR特异性检测结果

表1 荧光定量PCR重复性检测结果

2.4 应用性检测

对37份田间样品进行检测，发现阳性检出率为67.5%（25/37），且检测耗时短，减少了操作过程中产生的交叉污染。

3 讨论

进入21世纪，随着分子生物学技术的快速发展，应用于巴贝斯虫分类、鉴别和诊断的分子生物学研究方法也越来越多。由于荧光定量PCR可直接检测病原体，扩增反应结束后可直接判定结果，无需进行电泳检测，因而加快了检测效率，而且检测结果通过荧光信号来判定，灵敏度高于普通PCR。该方法是疾病早期诊断和流行病学调查的有效工具。因此，越来越多的巴贝斯虫靶基因如18S rRNA、转录间隔区、线粒体DNA、细胞色素b 基因等被标记用于牛巴贝斯虫的荧光定量PCR方法的建立。

刘启生等[15]针对牛巴贝斯虫18S rRNA基因设计引物和TaqMan探针，建立了实时荧光PCR检测方法，最低可检测到1.31×101copies/μL靶基因，敏感性较常规普通PCR方法提高了1 000倍；若考虑试验为40个循环，其敏感性为1.31×102copies/μL靶基因。本研究建立的牛巴贝斯虫TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，在40个循环的基础上敏感性最低可至1×102copies/μL靶基因，敏感性更强；该方法可更好地鉴别多种牛梨形虫病，对牛双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫等7种常见的牛梨形虫病检测结果均为阴性；重复性好，组内和组间重复试验变异系数均小于2.5%。通过对37份田间样品进行检测，发现阳性样品检出率为67.5%，表明本方法对田间样品的感染具有较高的检出率。

综上所述，本试验建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR灵敏度高、特异性好、稳定性强，适用于牛巴贝斯虫的诊断，从而为该病流行病学调查提供了快速有效的检测方法。