西草净对斑马鱼的急性毒性研究

蒋利生 吴晓峰 康杰

摘要 [目的]评价西草净原药对斑马鱼的毒性。[方法]以斑马鱼为研究对象，将其暴露在不同浓度的西草净中，观察中毒症状及死亡情况，计算其半致死浓度（LC50） 和安全浓度（SC） 。[结果]暴露时间为24、48、72、96 h时的LC50分别为9.984、8.397、7.923、7.923 mg/L，安全浓度分别为0.998 4、0.939 7、0.792 3、0.792 3 mg/L，参照GB/T 31270.12—2014，西草净对斑马鱼属于中毒农药。[结论]西草净对斑马鱼具有一定的影响，应科学合理的使用，避免进入水体。

关键词 斑马鱼;西草净;半致死浓度

中图分类号 X503.22  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）18-0063-02

Abstract [Objective] To evaluate the toxicity of simetryn to zebrafish.[Method]Taking zebrafish as the research object， it was exposed to simetryn of different concentrations，  the symptoms of poisoning and death were observed， and the semilethal concentration （LC50） and safe concentration （SC） were calculated.[Result]The LC50 at exposure times of 24， 48， 72， and 96 h were 9.984， 8.397， 7.923，and 7.923 mg/L， and the safe concentrations were 0.998 4， 0.939 7， 0.792 3， and 0.792 3 mg/L， respectively. According to GB/T 31270.12-2014， simetryn was toxic to zebrafish.[Conclusion]Simetryn has certain influence on zebrafish， so it should be used scientifically and reasonably to avoid entering water.

Key words Zebrafish;Simetryn;Median lethal concentration

西草凈（Simetryn）属均三氮苯类除草剂，化学名称为 2-甲硫基-4，6二（乙胺基）-1，3，5-三嗪，是1959 年由瑞士嘉基（Geigy）公司研发的一种内吸传导型选择性芽前土壤处理剂，可用于水稻、玉米、大豆、小麦、花生、棉花等作物田间除草[1-3]，其作用方式为抑制光合作用希尔反应，影响糖类的合成和淀粉的积累，从而达到除草效果[4]。庄占兴等[5]研究发现，西草净对谷子田1年生阔叶杂草、莎草科杂草活性高，使用剂量低于600 g/hm2时对稻谷安全;赵永成[6]研究证明，西草净能有效防除水稻田莎草科杂草和阔叶杂草，且对水稻安全。因具有安全、高效、高选择性等特点，且降解半衰期小于30 d，属易降解农药[7]，因此，西草净具有广阔的市场前景。

斑马鱼（Barchydanio rerio）是一种常见的模式动物，具有繁殖周期短、胚胎透明、个体小、易于养殖、对水质污染与毒性物质反应灵敏等特点，因此被广泛应用于毒理学、生态风险评估等研究。目前关于西草净对环境靶标生物的研究较少，该研究参照《化学农药环境安全评价准则》[8]和OECD试验准则[9]，以斑马鱼为受试对象，研究西草净对斑马鱼的急性毒性，以评价西草净的毒性效应、环境风险，为其实际田间应用提供理论依据，并为农业生产提供环境安全保障。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 主要仪器：LC-20A型高效液相色谱仪带二极管阵列检测器和化学工作站（日本岛津公司），AUY220万分之一电子天平（日本岛津公司），HQ40d便携式多参数数字化分析（美国哈希公司），YD200型水总硬度测定仪（上海三信仪表厂）等。

试剂与药品：丙酮（分析纯）和吐温-80购于国药集团化学试剂有限公司;曝气自来水，由实验室制备;西草净，质量百分数纯度为97.0%，购于山东滨农科技有限公司。

1.2 试验生物

斑马鱼购于水族馆，在试验室条件下驯养8 d，每天光照12 h，及时清除粪便及食物残渣，死亡率为1.5%。驯养期间每天喂食市售配合饵料2次，试验前24 h停止喂食，试验期间不喂食。选择大小一致、健康无病的斑马鱼进行试验，根据抽样结果所得，试验所用斑马鱼平均体长2.23 cm，平均体重0.212 6 g，试验过程中最大承载量不超过1.0 g鱼/L水。

1.3 试验条件 试验用水硬度为102～145 mg/L（CaCO3计），pH为6.5～8.0，溶解氧大于空气饱和值的65%，水温在（25±1）℃范围内，光暗比为12 h/12 h。

1.4 试验方法

1.4.1 参比物试验。

用重铬酸钾进行参比物试验，设计浓度为100.00、140.00、196.00、274.40、384.16 mg/L，每处理10条斑马鱼，试验周期24 h，观察并记录试验用鱼的中毒症状和死亡数，用玻璃棒轻触鱼尾部无可见运动即可判定为死亡，及时清除死鱼。参比物质重铬酸钾对斑马鱼24 h的LC50值应处于200～400 mg/L。

1.4.2 鱼类急性毒性试验。

根据预试验结果，设计西草净标示浓度为4.82、5.79、6.94、8.33、10.00、12.00 mg/L。定量称取西草净原药置于烧杯，加入丙酮溶解，再加入吐温-80搅匀，蒸馏水稀释后转入1 000 mL的容量瓶中定容，得到母液浓度为500 mg/L，分别从母液中移取28.94、34.72、41.67、50.00、60.00、72.00 mL于1 000 mL容量瓶中，曝气自来水定容后转入鱼缸中，再分别向鱼缸中加入2 L曝气自来水后搅匀，同时设置溶剂为丙酮和吐温-80的溶剂对照组和空白对照组，每处理设置3个重复，每重复接入10条斑马鱼，置于水浴槽中培养，试验期间不给食。试验开始后分别于24、48、72、96 h观察并记录试验用鱼的中毒症状和死亡数，用玻璃棒轻触鱼尾部无可见运动即可判定为死亡，及时清除死鱼。计算24、48、72、96 h的LC50和95%置信区间，安全浓度SC=LC50×0.1。

1.4.3 药液实际浓度检测。

为获得更准确的试验结果，在0和96 h分别取样进行药液中实际浓度的检测，色谱条件为：色谱柱：InertSustain C18，250 mm×4.6 mm（i.d）不锈钢柱，5 μm;柱温：30 ℃;流速：0.8 mL/min;检测波长：260 nm;进样量：20 μL;流动相：乙腈+水（水中含0.05%磷酸）=50+50（V/V）。

1.5 数据处理 采用SPSS 16.0对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 参比物试验结果

斑马鱼为供试生物的参比物试验中，重铬酸钾对斑马鱼LC50（24 h）为230.4 mg/L;95%置信限为204.11～260.08 mg/L，说明该批次斑马鱼能用于试验，所采用的设备、条件和方法也符合要求。

2.2 急性毒性试验结果

西草净处理斑马鱼后，斑马鱼出现了游动缓慢、沉底、腹部充血等症状，其中对游动的抑制症状最明显，与暴露浓度呈正相关，试验期间，各处理均出现死亡斑马鱼。图1表明，随着西草净浓度的升高，斑马鱼死亡率越来越大，随着染毒时间的推移，斑马鱼死亡率也逐漸升高，但在72 h后趋于稳定。试验过程中取0和96 h的药液上机检测，西草净实测浓度（表1）变化范围未超过20%，因此在毒性数据处理中采用标示浓度进行毒性数据分析，毒性结果见表2。表2表明，暴露时间为24、48、72、96 h时，西草净对斑马鱼的LC50分别为9.984、8.397、7.923、7.923 mg/L，安全浓度分别为0.998 4、0.939 7、0.792 3、0.792 3 mg/L，西草净对斑马鱼的LC50值和安全浓度均随着染毒时间的推移，数据变小，毒性增高。

3 讨论

随着农业的不断发展，除草剂的使用量日益增加，农药施用后，通过漂移、雨水冲刷等进入水环境中，会对鱼类造成不同程度的影响。有研究发现，不同除草剂对斑马鱼的毒性具有差异，不同生命阶段的斑马鱼对除草剂的敏感性也有所不同[10]，阿特拉津在20 mg/L时便导致斑马鱼的死亡，并且影响斑马鱼胚胎的孵化率，阿特拉津30 mg/L 时会导致斑马鱼脊索弯曲[11]，苄嘧磺隆对斑马鱼具有一定的遗传毒性[12]。

该研究发现，96 h时西草净对斑马鱼的LC50为7.923 mg/L，依据《化学农药环境安全评价试验准则》[8]第12部分鱼类急性毒性试验（GB/T 31270.12—2014），农药对鱼类的急性毒性按LC50的大小划分为4个等级：LC50（96 h）>10 mg/L为低毒，1.0 mg/L

参考文献

[1] 柏亚罗， 石凌波. 三嗪类除草剂的全球市场及发展前景[J]. 现代农药，2018，17（3）：1-8.

[2] 刘华中. 三氮苯类除草剂西草净一取代反应影响因素的研究[J].黑龙江科技信息， 2011（32）：39.

[3] 薛连海，丁斌.异丙醇-水为溶剂合成西草净[J].农药，2006，45（9）：598-600.

[4] 王凤芝， 张晓东. 25%西草净可湿性粉剂防除稻田水生杂草药效试验[J]. 安徽农学通报， 2006，12（12）：139-140.

[5] 庄占兴，孙文国，范金勇，等.西草净对谷子田一年生杂草活性及其安全性测定[J].农药，2017，56（7）：531-534.

[6] 赵永成.55%西草净可湿性粉剂防除水稻田杂草药效试验[J].北方水稻，2017，47（6）：24-26.

[7] 侯志广，密东林，赵晓峰，等.25%西草净WP在水稻、田水和土壤中的残留动态分析[J].农药，2014，53（7）：506-508.

[8] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局，中国国家标准化管理委员会.化学农药环境安全评价试验准则 第12部分：鱼类急性毒性试验：GB/T 31270.12—2014[S]. 北京：中国标准出版社， 2014.

[9] OECD.OECD guideline for testing of chemicals，test No.203： Fish，acute toxicity test[S].Paris：OECD，1992.

[10] 程艳红，葛婧，胡高洁，等.3种酰胺类除草剂对斑马鱼不同生长阶段的急性毒性效应[J].生态毒理学报，2017，12（6）：171-178.

[11] 郝明娇，王静慧，王丰，等.除草剂阿特拉津对斑马鱼胚胎毒性的研究[J].科技视界，2018（22）：68-69.

[12] 姜罡丞.苄嘧磺隆对斑马鱼的急性毒性和遗传毒性研究[J].安徽农业科学，2009，37（32）：15879-15881.

[13] SAKA M. Acute toxicity of rice paddy herbicides simetryn， mefenacet， and thiobencarb to Silurana tropicalis tadpoles[J]. Ecotoxicology and environmental safety， 2010， 73（6）：1165-1169.

[14] SAKA M，TADA N，KAMATA Y.Application of an amphibian （Silurana tropicalis） metamorphosis assay to the testing of the chronic toxicity of three rice paddy herbicides：Simetryn， mefenacet， and thiobencarb[J]. Ecotoxicology and environmental safety， 2013， 92：135-143.