HPLC法同时测定生脉饮中3种成分的含量

王永红 原欢欢 王雪莹

[摘要]目的 建立同时测定生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的高效液相色谱（HPLC）法。方法 采用Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱;甲醇-水（72∶28）为流动相;柱温为30℃;检测波长为254 nm;流速为1.0 ml/min。结果 五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素进样量分别在0.5975～9.5600 μg（r=0.9999）、0.0750～1.1990 μg（r=0.9998）、0.1888～3.0210 μg（r=0.9999）范围内线性关系良好，精密度、稳定性、重复性良好，加样平均回收率分别为99.3%、98.9%、98.6%，RSD分别为0.9%、1.5%、1.2%。对天诚制药的5批次生脉饮样品中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量进行测定，结果稳定。结论 本方法简便、准确、稳定，可用于生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量测定。

[关键词]生脉饮;高效液相色谱法;五味子醇甲;五味子甲素;五味子乙素

[中图分类号] R286          [文献标识码] A          [文章编号] 1674-4721（2020）8（c）-0046-04

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography （HPLC） method for the simultaneous determination on the components of schizandrin A， deoxyschizandrin， schizandrin B in Shengmaiyin. Methods An Agilent Eclipse Plus C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） column was used， methanol-water （72∶28） was used as the mobile phase， the column temperature was 30°C， the detection wavelength was 254 nm， and the flow rate was 1.0 ml/min. Results The sample size of schisandrin A， deoxyschizandrin， and schisandrin B showed a good linear relationship within the range of 0.5975-9.5600 μg （r=0.9999）， 0.0750-1.199 μg （r=0.9998）， and 0.1888-3.0210 μg （r=0.9999）， with good precision， stability， and repeatability， the average recovery rate of sample addition was 99.3%， 98.9%， 98.6%， and the RSD was 0.9%， 1.5%， 1.2%， respectively. The contents of schisandrin A， deoxyschizandrin， and schisandrin B in 5 batches of Shengmaiyin samples from Tiancheng Pharmaceutical Co.， Ltd. were determined， and the results were stable. Conclusion This method is simple， accurate， simple and stable， and can be used for the determination of schisandrin A， deoxyschizandrin and schisandrin B in Shengmaiyin.

[Key words] Shengmaiyin; High performance liquid chromatography; Schisandrin A; Deoxyschizandrin; Schizandrin B

生脈饮，又名生脉散，由红参、麦冬、五味子3味中药组成，具有益气复脉、养阴生津之功效。用于气阴两亏、心悸气短、脉微自汗[1]。生脉饮有广阔的市场前景，收载于《中华人民共和国药典》[1]（简称《中国药典》）一部2015版，其主要有效成分为皂苷类、多糖类、黄酮类、木脂素类等物质，其中，木脂素类等物质为五味子的主要成分[2-3]。虽然高效液相色谱-质谱（HPLC-MS）法可同时测定生脉饮中7种木脂素的含量[4-5]，但该方法要求较高，运用较受限。HPLC法应用更广泛，但目前仅有单独测定五味子醇甲[6-12]或同时测定五味子甲素和五味子乙素两种成分[13]的研究报道;测定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的相关报道较少。本研究参考相关文献[14-16]，建立了同时测定生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的HPLC方法，现报道如下。

1材料与方法

1.1主要仪器与材料

Agilent1260-DAD HPLC仪（安捷伦）;TDZ5-WS型多管架自动平衡离心机（湘仪）;HH-8型数显恒温水浴锅（金坛市华特）;METTLER AE240型电子分析天平（梅特勒-托利多）;甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸馏水;五味子醇甲对照品（批号：110857-201412）、五味子甲素对照品（批号：110764-201513）、五味子乙素对照品（批号：110765-201512）均购自中国食品药品检定研究院;生脉饮（太极集团·四川天诚制药有限公司，规格：10 ml×10支）;阴性样品（实验室自制）。

1.2方法

1.2.1色谱条件  色谱柱：Agilent Eclipse Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱温：30℃;流动相：甲醇-水（72∶28）;流速：1.0 ml/min;检测波长：254 nm。

1.2.2对照品溶液的制备  精密称取对照品，用甲醇制备成混合对照品溶液（浓度分别为478.00、59.96、151.04 μg/ml）。

1.2.3供试品溶液的制备  精密量取生脉饮20 ml，置于分液漏斗中，用正己烷萃取5次，30 ml/次，离心，合并正己烷层，85℃水浴蒸干，固体用甲醇溶解并定容至5 ml，摇匀，取滤液既得。

1.2.4阴性样品溶液的制备  取按照生脉饮处方配制不含五味子的阴性样品，依“1.2.3”项下方法制备既得。

1.2.5专属性实验  按照“1.2.1”项下的色谱条件，取“1.2.2”项下对照品溶液、“1.2.3”项下供试品溶液及“1.2.4”项下阴性样品溶液，分别注入HPLC仪，进行检测，记录色谱图。

1.2.6线性关系实验  精密取“1.2.2”项下对照品溶液，用甲醇逐级稀释制成5个浓度梯度，按照“1.2.1”项下的色谱条件，注入HPLC仪，以进样量X（μg）对峰面积Y进行线性回归，绘制标准曲线。

1.2.7精密度实验  按照“1.2.1”项下的色谱条件，取“1.2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，记录每次的色谱峰面积，计算RSD值。

1.2.8稳定性实验   按照“1.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、6、12、24 h依次进样，记录峰面积，计算RSD值。

1.2.9重复性实验  取生脉饮（批号：17120014）样品，按照“1.2.3”项下制备方法平行制备6份，按照“1.2.1”项下色谱条件，进样测定，计算RSD值。

1.2.10加样回收率实验  精密量取6份已测含量的生脉饮（批号：17120014）各10 ml，再加入不同量按照“1.2.2”项下制备的对照品溶液和“1.2.3”项下制备的供试品溶液，按照“1.2.1”项下色谱条件，进样检测，计算加样回收率。

1.2.11样品含量测定  按照上述所建方法，测定太极集团·四川天诚制药有限公司所生产的5批次生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量。按照“1.2.3”项下制备供试品溶液，测定并计算含量。

2结果

2.1专属性实验结果

按照“1.2.5”项下进行实验，结果显示，阴性样品溶液在供试品溶液主峰处无干扰（图1），方法专属性良好。

2.2线性关系实验结果

按照“1.2.6”项进行实验，结果显示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素分别在0.5975～9.5600、0.0750～1.1990、0.1888～3.0210 μg范围内，线性关系良好（表1）。

2.3精密度实验结果

按照“1.2.7”项进行实验，结果显示，连续进样6次五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为1.3%、0.6%、1.1%，提示仪器精密度良好。

2.4稳定性实验结果

按照“1.2.8”项进行实验，结果显示，供试品溶液中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为0.9%、1.2%、1.5%，提示样品在24 h内稳定。

2.5重复性实验结果

按照“1.2.9”项进行实验，结果显示，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量（n=6）的RSD均<2.0%，提示该方法重现性良好。

2.6加样回收率实验结果

按照“1.2.10”项进行实验，结果显示，本方法检测生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素含量的平均回收率分别为99.3%、98.9%、98.6%，且RSD值均<2.0%。

2.7样品测定结果

按照“1.2.11”项进行实验，测定天诚制药5个批次生脉饮样品五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量，结果显示，5批次生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分别为39.87、4.63、11.24 μg/ml（表3）。

3讨论

生脉饮疗效确切，拥有广阔的市场前景。但现行HPLC检测方法中仅有单独测定五味子醇甲或同时测定五味子甲素和五味子乙素两种成分的研究。为保证生脉饮产品质量，本研究建立了对生脉饮的质量控制方法，采用HPLC法同时测定生脉饮中3种有效成分（五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素）的含量。

本实验建立生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的含量测定方法，具有操作简单、阴性無干扰、灵敏度高、分离效果好等优点。本实验结果显示，5批生脉饮中五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的平均含量分别为39.87、4.63、11.24 μg/ml。本实验可为生脉饮中质量控制研究提供理论依据，更可为全面反映药品质量和其他制剂研究提供借鉴。

实验过程中还进行了色谱柱和流动相对比实验（由于篇幅所限，结果中并未全部列举），其中色谱柱分别采用Thermo Syncronis C18、Agilent Eclipse Plus C18和Welch Ultimate XB-C18，结果显示，Agilent Eclipse Plus C18的分离测定效果最佳，重复性、稳定性也都更好。流动相对比实验分别使用甲醇-水（77∶23）、（13∶7）、（62∶38）和（72∶28），结果显示，甲醇-水（72∶28）更适合同时测定五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素。