暗纹东方鲀鱼精蛋白的提取工艺优化研究*

张家源 张洪才 陈舜胜

暗纹东方鲀鱼精蛋白的提取工艺优化研究*

张家源1,2张洪才1,2陈舜胜1,2①

(1. 上海海洋大学食品学院 上海 201306；2. 国家淡水水产品加工技术研发分中心(上海)食品科学与工程国家级实验教学示范中心(上海海洋大学) 上海 201306)

以暗纹东方鲀()精巢组织为原料，采用酸提法提取鱼精蛋白。以得率为指标，通过正交实验，确定了最佳的提取参数。结果显示，提取鱼精蛋白的影响因素重要性依次为：提取次数>硫酸用量>硫酸浓度>95%乙醇用量；最佳提取工艺条件：硫酸浓度为0.2 mol/L、硫酸用量为2.5倍、提取次数为2次、95%乙醇用量为2.5倍。在此工艺条件下，暗纹东方鲀鱼精蛋白的得率为3.82%，蛋白含量达89.01%。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)可知，提取的粗鱼精蛋白有2个条带，分子量分别在25和20 kDa附近。分析其氨酸酸组成发现，暗纹东方鲀鱼精蛋白属于双鱼精蛋白，其中，精氨酸和丙氨酸含量相对较高，分别占31.40%和17.39%。本研究对暗纹东方鲀鱼精蛋白更好地应用在食品和医药领域具有重要意义。

暗纹东方鲀；鱼精蛋白；提取；工艺优化

鱼类的精巢俗称鱼白，因其具有特殊的气味，常被作为废弃物丢弃，是鱼类加工的副产品之一。从鱼类的精巢中可以提取到一种碱性蛋白质，即鱼精蛋白。鱼精蛋白(Protamine)又称精蛋白，是一种高度聚阳离子肽，可代替精子细胞中的组蛋白，当其与DNA结合时形成核蛋白，等电点在11~13之间(Xie, 2018; Egawa, 2008; Fu, 2019; Potter, 2005)。鱼精蛋白的分子量较小，由30~50个氨基酸组成，可溶于水，不溶于丙酮、乙醚等有机溶剂，富含核酸、蛋白和微量元素等活性成分(陈金梅等，2015)。由于鱼精蛋白特殊的生物学组成而使其异于其他蛋白质有着独特的功能。鱼精蛋白是肝素唯一的拮抗剂，可用于外科手术后中和肝素，同时，由于鱼精蛋白具有良好的生物兼容性，因此，可作为运输药物的载体(Gill, 2006; Kishimoto, 2012; Park, 2017; González-Aramundiz, 2015; Sommers, 2017)。此外，鱼精蛋白还可作为一些食品中的抗菌成分应用在食品保鲜领域，具有安全性高、抗菌性能好、热稳定性高等优点。其在碱性条件下具有明显的抗菌活性，是一种很有前途的抗菌剂(Guan, 2017)。因此，无论在医学领域还是食品领域，鱼精蛋白都有着重要的作用和应用价值。

鱼精蛋白常以DNA-蛋白质的形态存在，其结合键不牢固，易断开，可用硫酸将其断开，制成鱼精蛋白硫酸盐，再用有机溶剂析出沉淀(李若绮等, 2014)。提取反应过程：DNA-蛋白质+H2SO4→硫酸鱼精蛋白+DNA+H2O(吴燕燕等, 1999)。对DNA-核蛋白和RNA-核蛋白溶解度的研究发现，当NaCl浓度为 0.14 mol/L时，DNA-核蛋白溶解度仅为水中溶解度的1%，而RNA-核蛋白有相当大的溶解度，因此，选用0.14 mol/L NaCl来沉淀DNA-核蛋白(谢俊杰等, 2002)。因鱼的种类不同，提取得到的鱼精蛋白也存在较大差异。目前，国内外学者主要从鲑鱼()和鲱鱼()的成熟精巢中提取鱼精蛋白，而对河鲀()鱼精蛋白的研究较少。河鲀，又名鲀、吹肚鱼、气泡鱼等，属硬骨鱼纲、鲀形目、鲀科、东方鲀属，主要分布在我国渤海、东海、黄海及江河下游，为近海与河川底层肉食性海产有毒鱼类(杨春等, 2003)。野生河鲀毒性较高，而人工养殖的河鲀基本无毒。中国河鲀资源丰富，据统计，中国海水养殖河鲀产量约为23000 t，淡水养殖河鲀产量约为5000 t。暗纹东方鲀()是主要养殖种类之一，主要养殖区域是江苏、广东和福建地区(张迪等, 2017)。江苏地区主要为淡水养殖河鲀，产量约占全国总河鲀淡水养殖的68%。

本研究以暗纹东方鲀精巢为原料，采用酸法提取鱼精蛋白，通过6个单因素实验，探讨硫酸浓度、硫酸用量、提取时间、提取次数、提取温度和95%乙醇用量对鱼精蛋白提取的影响，并通过正交法优化其提取工艺，得到最佳提取工艺条件，通过十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)分析暗纹东方鲀鱼精蛋白的分子量，并对其氨基酸含量进行测定。本研究对河鲀精巢的高效利用具有重大意义，以期河鲀鱼精蛋白可以更好地应用在食品和医药领域。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

暗纹东方鲀精巢(2019年2月，冷冻运输)江苏中洋集团提供。

NaCl、95%乙醇、丙酮、乙醚和硫酸(均为分析纯)，国药集团上海化学试剂有限公司；考马斯亮蓝染色液G-250、SDS-PAGE电泳液、BeyoGelTMSDS- PAGE预制胶(4%~20%)，上海碧云天生物技术有限公司；2×Protein Loading Buffer，天根生化科技(北京)有限公司；Real Band蛋白预染，美国Marker Bio Basic Inc (BBI)；蛋白定量测试盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器与设备

FJ-200高速分散均质机，上海标本模型厂；GL- 26M/MI立式高速冷冻离心机，上海赵迪生物科技有限公司；AUW320电子分析天平，日本岛津公司；凝胶成像系统，上海天能科技有限公司；UV-1800PC紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；氨基酸自动分析仪L-8800，日本日立公司；LGJ-12冷冻干燥机，河南兄弟仪器设备有限公司；DHG-9076A 型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TY-80A/S脱色摇床，江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；DYCZ-24DN电泳槽、DYY-6C型电泳仪，北京六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品制备 将暗纹东方鲀精巢组织解冻后，用蒸馏水清洗干净(主要去除附着的杂物，如结缔组织、腺体、脂肪等)，沥干水分，分装在密封袋中(每袋约200 g)，–30℃冷藏备用。

1.3.2 原料基本营养成分测定 水分测定参考(GB 5009.3-2016)《食品中水分的测定》中的直接干燥法；灰分测定参考(GB 5009.4-2016)《食品中灰分的测定》中的食品中总灰分的测定；蛋白质测定参考(GB 5009.5-2016)《食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法；脂肪测定参考(GB 5009.6-2016)《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法。

1.3.3 暗纹东方鲀鱼精蛋白提取工艺 工艺流程：解冻后的精巢组织→捣碎→匀浆→离心→弃上清液，沉淀重复操作1次→H2SO4溶液提取→离心→收集离心的上清液→过滤→冷乙醇沉淀→丙酮洗涤→乙醚洗涤→冷冻干燥→鱼精蛋白粗品。

参照白婵等(2018)和曹文红等(2017)的方法稍作修改。称取100 g暗纹东方鲀精巢于组织捣碎机中，加入2倍体积0.14 mol/L的NaCl溶液，匀浆1 min，冰浴搅拌15 min，静置15 min，于4℃、8000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀重复操作1次，收集沉淀，加入H2SO4，在一定温度下提取一定时间，4℃、10000 r/min离心10 min，收集离心的上清液，过滤，滤液用一定体积的95%乙醇冰浴沉淀过夜后离心，所得沉淀用丙酮洗涤2次，乙醚洗涤1次，冷冻干燥即得暗纹东方鲀鱼精蛋白粗品。

1.3.4 硫酸提取法提取条件单因素实验

(1)硫酸浓度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸用量为3倍(ml/g)，提取温度为(25±1)℃，提取时间为0.5 h，提取2次，95%乙醇用量为3倍(ml/g)，分别控制硫酸浓度为0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mol/L，探讨硫酸浓度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

(2)硫酸用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸浓度为0.3 mol/L，提取温度为(25±1)℃，提取时间为0.5 h，提取2次，95%乙醇用量为3倍(ml/g)，分别控制硫酸用量为1、2、3、4和5倍，探讨硫酸用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

(3)提取次数对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸浓度为0.3 mol/L，硫酸用量为3倍(ml/g)，提取温度为(25±1)℃，提取时间为0.5 h，95%乙醇用量为3倍(ml/g)，分别控制提取次数为1、2、3、4和5次，探讨提取次数对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

(4)提取时间对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸浓度为0.3 mol/L，硫酸用量为3倍(ml/g)，提取温度为(25±1)℃，提取2次，95%乙醇用量为3倍(ml/g)，分别控制提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h，探讨提取时间对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

(5)提取温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸浓度为0.3 mol/L，硫酸用量为3倍(ml/g)，提取时间为0.5 h，提取2次，95%乙醇用量为3倍(ml/g)，分别控制提取温度为10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，探讨提取温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

(6) 95%乙醇用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

设定硫酸浓度为0.3 mol/L，硫酸用量为3倍(ml/g)，提取温度为(25±1)℃，提取时间为0.5 h，提取2次，分别控制95%乙醇用量为1、2、3、4和 5倍，探讨95%乙醇用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响。

1.3.5 硫酸提取法正交实验 根据单因素实验结果，选择硫酸浓度、硫酸用量、提取次数和95%乙醇用量进行L9(34)正交实验，以确定暗纹东方鲀鱼精蛋白的最佳提取工艺条件，实验因素与水平设计见表1。

表1 L9(34)暗纹东方鲀鱼精蛋白提取工艺正交实验设计因素水平

Tab.1 Factors and their levels used in L9(34 ) orthogonal design of the extraction of T. obscurus protamine experiments

1.3.6 暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的测定 准确称取10 mg提取的粗鱼精蛋白，用生理盐水定容至10 ml，配制成1 mg/ml的蛋白溶液。再用蛋白定量试剂盒进行测定。

蛋白质提取率按公式(1)计算：

式中，1为暗纹东方鲀鱼精蛋白得率(%)，1为蛋白质量(g)，0为暗纹东方鲀精巢质量(g)。

1.3.7 暗纹东方鲀鱼精蛋白相对分子质量的测定

采用十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)对提取的暗纹东方鲀鱼精蛋白进行分析，以确定该鱼精蛋白的相对分子质量。100 v恒压电泳约100 min，至溴酚蓝迁移至距凝胶下端约1 cm处，停止电泳，取出凝胶，用考马斯亮蓝染色液染色30 min，再用脱色液脱色至背景褪色、条带清晰可见(Compton, 1985; Sedmak, 1977; Schägger, 2006)。测量迁移距离，计算相对迁移率(f)(徐明生等, 2004)。

1.3.8 暗纹东方鲀鱼精蛋白的氨基酸组成 采用GB 5009.124-2016《食品中氨基酸的测定方法》进行样品前处理。

氨基酸自动分析仪条件：色谱柱(4.6 mm I.D.×60.0 mm)；分离树脂：阳离子交换树脂；柱温度： 57℃；检测波长：570 nm(脯氨酸440 nm)；1通道缓冲溶液流速：0.40 ml/min；反应液：茚三酮试剂；2通道反应液流速：0.35 ml/min；进样量：20 μl。

1.4 数据处理

所测结果为3次重复实验的平均值，采用Origin 8.5软件进行作图，SPSS Statistics 17.0软件进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 暗纹东方鲀精巢基本成分

暗纹东方鲀精巢的营养成分见表2。从表2可以看出，含水量较高，达80.22%；其次是粗蛋白，占湿重的的14.66%；脂肪含量较低，仅占湿重的1.73%。通过计算，粗蛋白占暗纹东方鲀精巢干重的74.12%，脂肪占8.75%，说明暗纹东方鲀精巢是富含蛋白质，而脂肪含量很低的产品，与胡晓璐等(2013)研究的鱿鱼精巢组织基本成分的结论一致。

表2 暗纹东方鲀精巢的基本成分

注: 各组分含量按湿重计

Note: The content of every composition was counted on wet weight

2.2 暗纹东方鲀鱼精蛋白提取工艺单因素实验

2.2.1 硫酸浓度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

硫酸浓度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响见图1。低浓度的硫酸对鱼精蛋白提取不完全，硫酸与鱼精蛋白结合较少，生成的鱼精蛋白硫酸盐较少，得率较低，适当提高硫酸浓度，可帮助拆分核酸与目标蛋白之间的键，提高目标蛋白得率，当浓度达到 0.3 mol/L时，蛋白的提取接近饱和，得率为3.51%，出现峰值后，得率会随浓度的增大而降低，此时，高浓度的硫酸会使蛋白质暴露出更多的疏水基团(Omana, 2010)，从而破坏蛋白结构，导致蛋白质可能被部分水解，降低了鱼精蛋白的含量。该结果与刘淑集等(2019)的研究一致，均表现出相对较高浓度的硫酸会使鱼精蛋白的得率下降。从图1中还可以看出，暗纹东方鲀鱼精蛋白受硫酸浓度影响明显，所以选择硫酸浓度值为0.3 mol/L为最适宜条件。

2.2.2 硫酸用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

硫酸用量对得率的影响见图2。硫酸用量从1 ml/g (体积与质量比，下同)增加到5 ml/g时，鱼精蛋白得率呈先升高、后降低，最后趋于平稳的变化趋势。当硫酸用量较少时，体系过小而导致鱼精蛋白溶解不完全，适当增加硫酸提取液有助于鱼精蛋白溶出，当硫酸用量为3 ml/g时，鱼精蛋白得率最高，蛋白质溶出达到饱和，继续增加硫酸用量，鱼精蛋白得率出现小幅度降低，主要是因为提取液体积过大，增加了操作体系的整体规模，也增大操了作过程中的损失率，因而对得率产生负面影响。故使得蛋白得率最大化的最佳硫酸用量为3 ml/g。

图2 硫酸用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率影响

2.2.3 提取次数对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

提取次数对鱼精蛋白得率的影响见图3。暗纹东方鲀鱼精蛋白经过2次提取后，继续增加提取次数时，得率反而降低，说明残渣中可提取的鱼精蛋白在第2次基本被提取完全，继续重复提取只会增加操作过程中的损失，降低鱼精蛋白得率。因此，提取次数2次为最佳。

图3 提取次数对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

2.2.4 提取时间对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

提取时间对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响见图4。随着提取时间从0.5 h延长到2.5 h，暗纹东方鲀鱼精蛋白得率整体呈下降趋势，说明延长提取时间不能提高鱼精蛋白的得率。从加入硫酸开始提取计时，0.5 h前，硫酸会辅助鱼精蛋白与核酸之间的键断开，随着时间的增加，得率逐渐降低，可能是因为之前被分离出来的鱼精蛋白被酸水解，因此，绝大多数的精蛋白都在0.5 h内被提取出来。综合来看，0.5 h时，鱼精蛋白溶解量与损失量差值达到最大化，得率较高，提取较为充分，故选取提取时间为0.5 h比较合适。

2.2.5 提取温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

提取温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响见图5。温度较低时，对鱼精蛋白得率产生副作用，当温度从10℃升高到50℃时，鱼精蛋白得率呈现先升高后趋于平稳的趋势。因为适当升高温度可使分子的运动速度加快，提高了蛋白的溶出率(洪晶等，2013)。继续增加温度，鱼精蛋白得率没有明显升高，而是在此基础上浮动，说明该鱼精蛋白的耐热性较好，不易受温度的影响而变性。总体来看，温度对河鲀鱼精蛋白的提取率影响并不大，提取得到的蛋白均为白色，因此，在简化提取条件和节约操作成本的角度考虑，选取室温提取比较好。

2.2.6 95%乙醇用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响 乙醇用量对鱼精蛋白得率的影响见图6。随着乙醇用量的增大，暗纹东方鲀鱼精蛋白得率呈先增长后降低的趋势，用量3倍时，得率达到最高点，继续增加乙醇用量，鱼精蛋白得率呈缓慢下降趋势，可能是乙醇用量过大，破坏了蛋白的结构，影响得率。因此，最佳用量为3 ml/g。

图5 提取温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的影响

图6 乙醇用量对暗纹东方鲀鱼精蛋白得率影响

2.3 暗纹东方鲀鱼精蛋白提取工艺优化

根据单因素实验结果，分别以硫酸浓度、硫酸用量、提取次数和95%乙醇用量为考察因素，以暗纹东方鲀鱼精蛋白得率为评价指标，按L9(34)进行正交实验，优化最佳提取条件，结果见表3。

由表3可知，在9个实验设计组中，第4组的提取效果最好，蛋白得率达到3.04%；其次为第2组，蛋白得率达到3.01%；由极差分析可知，影响暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的因素主次为：C>B>A>D，即提取次数>硫酸用量>硫酸浓度>95%乙醇用量。暗纹东方鲀鱼精蛋白提取最优工艺组合为A1B1C2D1，即硫酸浓度为0.2 mol/L、硫酸用量为2.5倍、提取次数为2次、冷乙醇用量为2.5倍。该工艺条件下提取的鱼精蛋白得率可达3.82%，高于各实验组中暗纹东方鲀鱼精蛋白的得率。

表3 L9(34)暗纹东方鲀鱼精蛋白提取工艺正交实验结果

Tab.3 L9(34) orthogonal result of the extraction of T. obscurus protamine

由表4可知，校正模型具有显著性，其中，硫酸浓度(A)、硫酸用量(B)对提取率的影响(<0.05)，提取次数(C)对提取率的影响(<0.01)，95%乙醇用量(D)对提取率的影响(>0.05)，依次对应与蛋白得率的关系依次为显著、显著、极显著和不显著。四者在暗纹东方鲀鱼精蛋白提取过程中需重点控制的顺序为：提取次数>硫酸用量>硫酸浓度>95%乙醇用量。

表4 正交实验方差分析

Tab.4 Analysis of variance of the experimental results of orthogonal array design

*：差异显著，<0.05；**：差异极显著，<0.01

*: The difference is significant,< 0.05; **: The difference is highly significant,<0.01

2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

利用十二烷基硫酸钠–聚丙烯酰胺凝胶电泳(Tricine-SDS-PAGE)确定暗纹东方鲀精巢中抗菌活性蛋白的相对分子量及分析其成分组成见图7。由图7可知，所提取的暗纹东方鲀精巢组织中的抗菌活性蛋白组分由2个条带组成，主体成分相对分子量在17~ 25 kDa之间。经计算，暗纹东方鲀鱼精蛋白2条区带的相对迁移率(f)分别为0.7814和0.8772。以标准蛋白分子量的对数为纵坐标，相对迁移率(f)为横坐标，进行直线回归分析(图8)，回归系数2=0.9934，回归方程为=–1.1073+2.2321。暗纹东方鲀鱼精蛋白的分子量分别为23.27和18.23 kDa。在相关鱼类精巢抗菌活性蛋白的研究中，此抗菌活性蛋白的相对分子质量大于徐明生等(2004)测得鲤鱼()抗菌鱼精蛋白纯品的分子量(15.32 kDa)。本研究提取的暗纹东方鲀粗鱼精蛋白有2个条带，分析其原因主要有2点，一是样品中含有其他杂蛋白，二是该蛋白质分子具有几个亚基。也有研究表明，鱼类精巢抗菌活性蛋白组分并不单一，它是由互相类似的数种成分组成。

图7 暗纹东方鲀鱼精蛋白Tricine-SDS-PAEG电泳

M：预染蛋白Marker；A：暗纹东方鲀鱼精蛋白

M: Pre-stained protein marker; A:protamine

图8 相对分子质量标准曲线

2.5 暗纹东方鲀鱼精蛋白的氨基酸组成

暗纹东方鲀鱼精蛋白的氨基酸组成见表5，从 表5中可以看出，丙氨酸和精氨酸是是该鱼精蛋白的主要氨基酸，相对含量分别为17.39%和31.40%，约占总氨基酸的50%。这与刘红玉等(2007)研究的大马哈鱼()的氨基酸组成较为类似，均含有较高的精氨酸。碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)占31.87%，与鲢鱼()中碱性氨基酸含量相近(谢俊杰等, 2001)。但与俞加林(1994)文中提到的精氨酸占2/3以上的结果有明显差别。分析其原因可能是随着时间的延长，人工养殖的河鲀由于食物、地理位置和环境等差异，导致目前河鲀精巢的氨基酸组成与过去有所差异。根据氨基酸的组成和种类，可将鱼精蛋白分为3类，分别是单鱼精蛋白、双鱼精蛋白和三鱼精蛋白。因暗纹东方鲀鱼精蛋白含有精氨酸和组氨酸，所以属于双鱼精蛋白。

表5 暗纹东方鲀鱼精蛋白氨基酸组成分析

Tab.5 Amino acid composition analysis of T. obscurus protamine

*：必需氨基酸；–：未检测到

*: Essential amino acid; – : Not detected

3 结论

本研究采用硫酸提取法提取暗纹东方鲀鱼精蛋白，通过正交实验法优化得到最佳提取工艺：硫酸浓度为0.2 mol/L、硫酸用量为2.5倍、提取次数为2次、冷乙醇用量为2.5倍。影响暗纹东方鲀鱼精蛋白得率的因素主次为：提取次数>硫酸用量>硫酸浓度>95%乙醇用量。温度对暗纹东方鲀鱼精蛋白的得率影响较小，说明暗纹东方鲀鱼精蛋白具有很好的耐热性。在最佳提取工艺条件下，暗纹东方鲀鱼精蛋白的得率最大为3.82%。由Tricine-SDS-PAGE电泳可知，鱼精蛋白的分子量较小，粗提法得到的鱼精蛋白经电泳后出现2个条带，说明该粗鱼精蛋白杂质较少。经计算，暗纹东方鲀鱼精蛋白的分子量分别为23.27和 18.23 kDa。丙氨酸和精氨酸是是该鱼精蛋白的主要氨基酸，相对含量分别为17.39%和31.40%，约占总氨基酸的50%。根据氨基酸的组成种类和数量来分，暗纹东方鲀鱼精蛋白属于双鱼精蛋白。该研究为河鲀鱼精蛋白的高效利用奠定理论基础。接下来可对该鱼精蛋白的理化特性进一步研究。

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Optimization of Extraction Process of Protamine from

ZHANG Jiayuan1,2, ZHANG Hongcai1,2, CHEN Shunsheng1,2①

(1. College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306;2. National Research and Development Branch Center for Freshwater Aquatic Products Processing Technology (Shanghai),National Experimental Teaching Demonstration Center of Food Science and Engineering (Shanghai Ocean University), Shanghai 201306)

The fish's testis, commonly known as fish white, is often discarded as waste owing to its specific odor and is one of the by-products of fish processing. A basic protein, protamine, can be extracted from the testis of fish. Protamine has the advantages of high safety, good antibacterial performance, and high thermal stability. It can be used as an antibacterial ingredient in some foods in the field of food preservation. It has obvious antibacterial activity under alkaline conditions and is a promising antibacterial agent. Here, the testis ofwas used as the raw material, and the protamine was extracted by acid extraction. The extraction coefficient was used to determine the optimal extraction parameters. According to the results of orthogonal test, the importance factors of the extraction of protamine are as follows: extraction times > sulfuric acid dosage > sulfuric acid concentration>95% ethanol; optimal extraction conditions are: sulfuric acid concentration 0.2 mol/L, sulfuric acid dosage is 2.5 times, the number of extractions was 2, and the amount of 95% ethanol was 2.5 times. Under this condition, the extraction rate of protamine fromwas 3.82%, and the protein content was 89.01%. According to the tricine-SDS-PAGE, the extracted crude protamine has two bands with molecular weights of 25 kDa and 20 kDa, respectively. Analysis of its lytic acid composition found that arginine and alanine content were relatively higher, accounting for 31.40% and 17.39%, respectively. This study is of great significance for the efficient use of testes of puffer-fish (dark-spotted oriental carp), and also lays a theoretical foundation for the application of stag beetle (dark-spotted oriental carp) protamine in the food and pharmaceutical fields.

; Protamine; Extraction; Process optimization

CHEN Shunsheng, E-mail: sschen@shou.edu.cn

TS254.4

A

2095-9869(2020)05-0020-09

10.19663/j.issn2095-9869.20190810001

http://www.yykxjz.cn/

张家源, 张洪才, 陈舜胜. 暗纹东方鲀鱼精蛋白的提取工艺优化研究. 渔业科学进展, 2020, 41(5): 168–176

Zhang JY, Zhang HC, Chen SS. Optimization of extraction process of protamine from. Progress in Fishery Sciences, 2020, 41(5): 168–176

* 国家自然科学基金面上项目(31471685)和上海市高校知识服务平台项目(ZF1206)共同资助[The work was supported by National Natural Science Foundation of China (31471685), and Shanghai University Knowledge Service Platform Project (ZF1206)]. 张家源，E-mail: JYZhangshou@163.com

陈舜胜，教授，E-mail: sschen@shou.edu.cn

2019-08-10,

2019-08-30

(编辑 陈 辉)