荧光定量检测试纸检测饲料中呕吐毒素

原小燕 王虎 刘映雪

摘要：本研究建立了饲料中呕吐毒素荧光定量检测方法。饲料样品经70%甲醇溶液提取，过滤后，用0.01MpH7.4PBS复溶，结果表明，呕吐毒素在0.5～8毫克/公斤浓度范围内线性关系良好，r2=0.999。以配合饲料、浓缩饲料、预混料为添加基质，其回收率在80%～120%，检出限为500ppb。结论显示，本方法灵敏度高，操作简单，结果准确，可满足饲料中呕吐毒素的分析检测。

关键词：呕吐毒素;饲料;荧光定量检测试纸

1材料与方法

1.1仪器与试剂

荧光免疫分析仪（苏州和迈精密仪器有限公司），XH-C涡旋混合器（新宝仪器有限公司），称量天平（DIGITAL SCALE）。呕吐毒素单克隆抗体和呕吐毒素半抗原一牛血清白蛋白偶联物，购自武汉优博生物技术有限公司;MES，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司;EDC，购自国药集团;试剂牛血清白蛋白，购自上海生工生物工程有限公司;时间分辨荧光微球，购自上海辉质生物科技有限公司;呕吐毒素及其他真菌毒素的标准品，购自Sigma公司;硝酸纤维素膜，购自MDI。

1.2试验方法

1.2.1样本处理方法称取2.0土0.05克研碎的样本至50毫升离心管中，加入10毫升样本提取液，用振荡器充分振荡5分钟，将振荡后的样本用定量分析滤纸过滤，用样本稀释液将滤液按1：79比例稀释（例，10微升滤液+790微升样本稀释液），取稀释后液体进行检测（稀释系数400）。

1.2.2操作步骤打开荧光免疫分析仪，同时撕开检测试纸铝箔袋，取出检测试纸，放于平整、洁净的台面上。用配套吸管吸取待检样本，垂直而缓慢的滴加2～3滴（约60微升）到加样孔内。静置10分钟，，上机检测，超过20分钟的结果无效。荧光免疫分析仪操作：轻按开机键开机——点击“系统设置”——点击“检测项目管理”——选择需检测的项目（呕吐毒素）——将检测试纸插人检测孔内——点击“快速测试”开始检测;检测下一个样本击“快速检测””即可当检测结果大于80微克/公斤时，可用样本稀释液将上述检测液稀释5倍后再进行检测，所得读数值乘以对应的稀释倍数即为最终的检验结果。

2结果与分析

2.1包被量的确定

用0.lMNa，HPO，将包被抗原（5.7毫克/毫升）按照0.399毫克/毫升，0.456毫克/毫升和0.513毫克/毫升划膜，37"C千燥待用，与结合垫、样品垫进行配对检测显示，选用0.456毫克/毫升包被时，梯度添加标准品，灵敏度最高，结果见表1。

2.2标记量的确定

微球清洗：50微升荧光微球加入1毫升0.01MMES缓冲液中，混匀，12000转/分钟离心15分钟;弃上清，加入1毫升0.01MMES缓冲液，混匀离心;重复上述步骤3次，并用1毫升0.01MMES缓冲液复溶。微球活化：向清洗后微球加入250微升/毫升EDC缓冲液，混匀，室温避光反应30分钟;12000转/分钟离心15分钟，弃上清，加入1毫升0.01MMES缓冲液，混匀，2000转/分钟离心15分钟。微球标记：弃上清，用4毫升0.05MPB9.0进行复溶，均分至4管分别加入0.8微升，1.0微升，1.2微升标记抗体（6.2毫克/毫升），室温避光反应30分钟。微球封闭：各加入100微升1M甘氨酸溶液混匀，室温避光反应15分钟;再各加人100微升10%BSA溶液混匀，室温避光反应15分钟;12000转/分钟离心15分钟。微球复溶：将离心后微球用复溶液复溶后，按照3微升/厘米喷量喷出。微球标记浓度检测：与包被膜样垫组合检测结果显示，标记抗体浓度是1微升/毫升时，梯度添加标谁月灵敏度最高，结果见表2，由表可知，最佳标记量是1微升/毫升。

2.3检测结果分析

2.3.1线性范围与检出限取6个无污染（阴性）精料样品和6个无污染（阴性）玉米样品，分别添加0.00毫克/公斤、0.5毫克/公斤、1毫克/公斤、2毫克/公斤、4毫克/公斤、8毫克/公斤的呕吐毒素标准品，用呕吐毒素荧光定量检测试纸条每个样品检测3次，以添加浓度为为纵坐标，以荧光定量检测试纸条的检测结果为横坐标，拟合曲线并计算线性相关系数，结果如计算得出粮食谷物的线性范围，0.5～8毫克/公斤，回归方程，y=0.99x-0.031相关系数，R2=0.998。

2.3.2准确性和重复性分析在用国标法测定为0的不同种类空白样品中分别添加呕吐毒素浓度为0.00毫克/公斤、0.5毫克/公斤、1毫克/公斤、2毫克/公斤、4毫克/公斤、8毫克/公斤的标准品，然后按照呕吐毒素荧光定量检测试纸条的检测方法进行检测。检测结果见表3。

从表3可以看出，呕吐毒素荧光定量检测试纸条测试不同粮食谷物中呕吐毒素的添加回收率在92.7%～105%，3次重复的变异系数在14.4%以内。

2.3.3与ELISA方法的对比试验结果取玉米粉、高梁、棉籽、甜菜粕、青贮玉米受污染样品各1份，先采用ELISA法進行测定，再使用呕吐毒素荧光定量检测试纸条进行测定，各测试3个平行样。检测结果如下。

表4表明在不同的粮食谷物饲料中，呕吐毒素荧光定量检测试纸与ELISA的符合率为95.7%～98.2%，3次重复的变异系数CV在11%以内。

2.4方法特异性

选择其他5种常见的真菌毒素的标准品在阴性玉米中进行添加，添加的浓度为1000微克/公斤，然后用呕吐毒素荧光定量检测试纸条进行测试，每个样品测3次取平均值。结果显示与赭曲霉毒素A，伏马菌素B，呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素的交叉反应率均《5%。实验结果表明，呕吐毒素荧光定量检测试纸条对赭曲霉毒素A，伏马菌素B，呕吐毒素、T-2毒素、玉米赤霉烯酮毒素几乎无交叉反应，其方法特异性可以满足检测要求。

3结论

本研究研发了一种呕吐毒素荧光定量检测试纸条，通过对不同的粮食谷物饲料样本进行测试，该产品的最低检出限为0.5毫克/公斤，线性范围为0.5～8毫克/公斤，线性范围内的添加回收率为92.7%～ll1.87%，3次重复的变异系数在14.4%以内。与其他真菌毒素的交叉反应率均《5%。其准确性和可靠性可以满足我国对呕吐毒素的分析标准的技术要求。该方法具有简单快速、谁确可靠、重复性好等特点，可用于不同粮食谷物饲料中呕吐素的快速定量检测分析。