非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

吴继阳

摘要：目的，分析间接ELISA抗体检测方法的建立以及非洲猪瘟病毒p了0基因的原核表达方式。方法，选择120例AFR质粒，按照随机分组方式，将其分为观察组与对照组，每组60个。对照组使用SDS一PAGE检测方法，观察组使用间接ELISA抗体检测方法，对比两组检测在非洲猪瘟病毒p30基因原核表达测算以及抗体检测当中的准确性，特异性，灵敏性和重复性。结果，观察组检测准确性高于对照组，具有显著差异（P《0.05），观察组检测特异性高于对照组，具有显著差异（P《0.05），观察组检测灵敏性高于对照组，具有显著差异（P《0.05），观察组检测重复性高于对照组，具有显著差异（P《0.05）。结论，使用间接ELISA抗体检测方法在非洲猪瘟病毒p30基因原核表达测算以及抗体检测当中具有良好效果，检测灵敏度，重复性均较高，可起到准确的检测效果。最终测算得出的灵敏度可达到1：1600，在短时间内的重复性和批量重复性异系数均小于10%。

关键词：非洲猪瘟病毒;p30基因原核表达;抗体检测方法

非洲猪瘟病毒主要可以引起非洲猪瘟疾病，表征主要以高热、淋巴结及脏器严重出血作为特征，具有较高的接触传染性，死亡率达到95%～100%。这种疾病不仅会严重影响养殖行业，还会影响经济发展，我国农业农村部将其列为一类动物疫病进行重点防治。检测血清中非洲猪瘟病毒抗体间接ELISA抗体检测方法可以对猪瘟p30基因原核表达方式进行有效的测算，同时相对于采用SDS-PAGE检测方法对重组蛋白进行鉴定。可以更加有效地提高检测的特异性，敏感性和重复性。从目前分析研究结果可以看出，使用间接ELISA抗体纯化重组蛋白作为语言抗检测进行基因测算，可以更加有效地对基因进行克隆，在原核表达载体测算当中可以获得显著效果。同时，这种检测还可以对Winston boarding病毒测算系列的纯化结果具有良好的优化浓度效果。本文主要结合病毒抗体SDS-PAGE检测方法以及间接ELISA抗体检测方法对重组蛋白进行表达界定。

1材料与方法

1.1一般材料

在实验范围内选择120例非洲猪瘟p30基因的质粒。采用试剂盒检测方式，由南京金斯瑞生物科技有限公司进行p30基因合成，探讨astarDNA聚合酶的含量，并通过连接酶质粒DNA小量纯化试剂盒进行有效检验。

1.2方法

对照组参照genbank已经公布的SDS-PAGE检测方式进行核苷酸序列测验，对上游引物ggtill以及下游引物酶切位点进行保护碱基测算。引用工程最终由上海嘉宝娜公司合成，并测定p30基因完整的开放阅读框，除此之外，对基因进行克隆以及质粒的构建，选择PCR模板进行扩建PCR反应的条件，在98C的范围内进行预变性测算，测算时间为2分钟。在98C范围内进行变.性基因测算测算时间为十秒钟，在56C范围内进行退火测算，实验时间为15秒钟，在72C范围内进行延伸变性实验，时间为45秒钟，共32个基因循环序列组。测算之后，采用试剂盒回收方法，对于双酶切p30基因片段核原核表达载体进行回收，并在16C范围内进行连续24小时的重组质粒检测。检测之后对Trace感受细胞进行细菌液检测，重组载体获得为pet-30。

观察组使用间接ELISA抗体检测方法建立间接抗体检测，首先对抗体最佳浓度和血清最佳稀释倍数进行确定，采用方正检测方式分别将重组蛋白稀释到37.1、18.6、9.34倍进行孔检测。其次在1：110：200浓度下，分别对测算事业进行稀释，稀释之后在37C范围内进行孵化，时长为1小时，在38C范围内进行孵化，时长为10分钟。对显示效果进行鉴定，挑选接近l.0的阳性值，再经过二次封闭液选择之后对酶标记浓度进行二次检测，通过临界值分析在上述优化時间范围之内进行基因序列检测，从而确定猪繁殖与呼吸倍数，从而判定阳性特性值。

1.3观察指标

观察两组检测重复性，灵敏度，特异性。

1.4统计学方法

统计学软件为SpSS21.0。计量资料采用t检验，以均数土标准差（x士s）表示;计数资料以X2检验，以率（%）表示。P《0.05表示差异有统计学意义。

2结果

观察组重复性情况显著好于对照组，两组之间具有显著差异（P《0.05）

观察组特异性显著好于对照组，两组之间具有显著差异（P《0.05）。观察组敏感性情况显著好于对照组，两组之间具有显著差异（P《0.05）。

3结论

使用间接ELISA抗体检测方法在非洲猪瘟病毒p30基因原核表达测算以及抗体检测当中具有良好效果，检测灵敏度，重复性均较高，可起到谁确的检测效果。最终测算得出的灵敏度可达到1：1600，在短时间内的重复性和批量重复性异系数均小小10%。