微生物菌剂对堆肥功能微生物重构的影响

刘东明， 孟繁华， 郝 艳， 侯佳奇， 叶美瀛， 李鸣晓， 席北斗*

1.中国环境科学研究院， 环境基准与风险评估国家重点实验室， 北京 100012 2.中国环境科学研究院地下水污染防控研究室， 北京 100012

好氧堆肥是实现有机废弃物资源化利用的一种重要方式[1-2]，堆肥产品作为有机肥或土壤调理剂具有一定的商业价值，也可以作为载体为原位生物脱氮提供更大的比表面积和更多的微生物附着点[3]，进而提高包气带土层防护地下水硝酸盐污染的效果.

堆肥是否能作为生物修复菌剂的载体，与其腐熟度有关，堆肥必须完全腐熟才能作为微生物菌剂吸附载体[4]. 由于堆肥的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，因此，堆肥的腐熟速度与堆体内的微生物直接相关. 研究[5-6]表明，在堆肥过程中接种高效微生物菌剂可以增加堆体中的微生物数量，加速垃圾中有机物的分解，促进堆肥材料的腐熟，提高堆肥效率. KE等[7]研究表明，在餐厨垃圾堆肥中接种耐热脂肪分解放线菌，能够减少堆肥粗脂肪含量，缩短堆肥腐熟时间. SONG等[8]将耐酸菌剂接种于餐厨垃圾堆肥，结果表明堆肥初期酸化问题得到解决. 也有研究认为，堆肥系统内微生物群体的数量和种类都是足够的，它们能够在适合的条件下快速繁殖[9-10]，因此，可以通过刺激土著微生物的方法达到快速启动堆肥的目的[11]. 另外，接种的微生物要与大量的土著微生物进行竞争，不能发挥其在纯培养条件下的物质分解潜力[12]. 通过微生物学研究阐明菌剂和堆肥土著微生物的相互作用对提高堆肥产品品质(腐熟度)至关重要.

现代分子生物学技术的发展开辟了堆肥原位微生物的研究途径，变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis，DGGE)等依赖于DNA分析的技术被引入堆肥微生物研究[13-15]. Bonito等[13]研究表明，与传统培养方法相比，DGGE指纹技术和DNA克隆文库序列分析法可从堆肥样品中得到不同的真菌分类群和更高的真菌丰富度，但是，由于分辨率等原因造成的偏差，使DGGE指纹技术的检测结果与实际微生物群落多样性存在较大差异，从而影响了对堆肥系统中微生物群落的全面了解[16]. 16S rDNA 高通量测序技术基于大规模数据分析微生物群落，具有更强的统计效力，但是对PCR产物的测序结果与实际情况仍有差异. 宏基因组学能够直接得到某一环境条件下微生物群落的整体结构信息，避免了试验偏差，但仍无法对微生物群落和功能间的关系进行解析. 基于RNA分析的宏转录组学通过研究特定环境群体细胞转录的所有RNA将微生物群落和功能联系到一起，但是其结果阐明的是微生物“准备做什么”，而不是“正在做什么”. 蛋白质尤其是酶类参与生命有机体的生物转化过程，因此，以“特定时间点内环境微生物所有蛋白质成分的总和”为研究对象的“宏蛋白质组学”[17]是构建微生物功能动力学最恰当、最全面的方法，也是了解代谢组学调节机制(生态系统中所有微生物的总代谢物信息)最重要的一步[18]. Benndorf等[19]报道了一种高效制备环境样品总蛋白质的方法，用此方法提取2，4-二氯苯氧乙酸污染土壤和氯苯污染地下水中的总蛋白质并进行分析，结果表明，宏蛋白质组学方法在研究环境微生物群体多样性和功能性方面较宏基因组学和宏转录组学更加快速.

鉴于此，该研究采用宏蛋白质组学方法，研究餐厨垃圾堆肥过程中接种木质纤维素混合菌剂对细菌和真菌群落结构以及功能的影响，深入分析堆肥过程中碳水化合物代谢途径的差异性，揭示外源菌剂与堆肥土著微生物的相互作用，以期为堆肥产品品质提升提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 堆肥原料

餐厨垃圾取自中国环境科学研究院食堂，麸皮购自农贸市场，木屑购自木材加工厂，腐殖土购自花卉市场. 餐厨垃圾CN为24.3∶1，有机质含量为80.9%，含水率为79.7%; 麸皮CN为31.4∶1，有机质含量为88.3%，含水率为9.2%.

1.2 堆肥设备

堆肥设备购自日本静冈制机株式会社. 如图1所示，该装置主体部分是有效容积为34 L的圆柱形不锈钢罐体，高0.4 m，直径0.33 mm，位于恒温箱中，底部设有布气板，由气泵进行布气；配有渗滤液收集装置、供气及计量系统、温控系统和出口气体在线检测仪器(O2-H2S气体检测仪和CO2检测仪).

注： 1—气泵； 2—气体流量计； 3—反应堆； 4—温差控制装置； 5—恒温箱； 6—气体测定仪； 7—过滤装置.图1 试验反应器示意Fig.1 Schematic diagram of experimental reactor

1.3 微生物菌剂

微生物菌剂制备：10 g腐熟堆肥(实验室堆制)中加入 1 000 mL蛋白胨纤维素液体培养基(蛋白胨5 g，NaCl 5 g，CaCO32 g，酵母粉1 g，麸皮5 g，去离子水 1 000 mL，121 ℃下灭菌20 min)中，50 ℃下静置培养至108CFUmL培养液，备用.

微生物菌剂组成：采用稀释涂布平板法从菌剂中分离出20株细菌和5株真菌，对细菌进行16S rDNA序列分析，对真菌进行28S rDNA序列分析. 20株细菌分为八大类，分别是Aeribacillussp.、Bacilluslicheniformis、Bacillusthermoamylovorans、Brevibacillusborstelensis、Geobacillussp.、Lysinibacillussp.、Paenibacillusdendritiformis、Ureibacillusthermosphaericus，都属于芽孢杆菌目(Bacillales); 5株真菌属于Aspergillussp.，散囊菌纲(Eurotiomycetes).

1.4 试验方案

设添加菌剂和不添加菌剂2个处理，其中接菌组的菌剂添加量(以干质量计)为5 mL/kg. 餐厨垃圾、腐殖土、麸皮添加量(以干质量计)比例为15∶7∶1，加入一些木屑作为填充剂用来改善堆体的孔隙结构和增加通风效果. 调节堆肥物料初始含水率为60%左右，通风量为0.5 L/(min·kg)(以干质量计). 分别在堆置5、15、30 d后在堆芯处取等量样品混匀.

1.5 总蛋白制备

采用Benndorf等[19]提取土壤中蛋白质的方法，从堆肥样品中提取胞内蛋白和胞外蛋白的混合物. 称取5 g新鲜堆肥样品加入20 mL 0.1 mol/L的NaOH预处理30 min，10 000 r/min、20 ℃下离心20 min. 取上清液加dH2O至16 mL，并与等体积液体苯酚(10 g苯酚加1 mL dH2O)混匀，20 ℃下振荡1 h，10 000 r/min、20 ℃下离心15 min. 取下层苯酚加入等体积dH2O洗涤，振荡5 min后离心. 取下层苯酚加入5倍体积的0.1 mol/L的乙酸铵甲醇溶液，-20 ℃下过夜沉淀蛋白，10 000 r/min、0 ℃下离心15 min. 沉淀用10 mL 0.1 mol/L的乙酸铵甲醇溶液悬浮，-20 ℃下孵育15 min，离心，沉淀分别用2 mL 0.1 mol/L的乙酸铵甲醇溶液、2 mL的80%丙酮和2 mL的70%乙醇洗涤(洗涤过程包括悬浮、-20 ℃下孵育、离心)，干燥后的固体物质即为堆肥样品中的总蛋白.

1.6 电泳分离

将制备的总蛋白用适量的SDS-PAGE上样缓冲液溶解，100 ℃下煮沸20 min，离心后取5 μL上清进行SDS-PAGE (Mini-PROTEAN Tetra system，Bio-Rad,德国)分析(4%浓缩胶，10%分离胶)，之后用2.5%的考马斯亮蓝R250染色观察(见图2). 将泳道分为12段切下，委托北京华大蛋白质研发中心有限公司进行测试，胰蛋白酶消化后，肽段通过nano-LC(Ultimate 3 000，Dionex公司)分离. Trap柱为Acclaim PePmap 100，75 μm×2 cm，Trap接头为nanoviper，C18，3 μm，100A (Thermo scientific公司)；分析柱为自制喷针一体柱，填料为Venusil×BPC，C18(L)，3.0 μm，150 mm×0.075 mm (Agela Technologies公司)，MS/MS (Q Exactive, Thermo Scientific公司).

图2 堆肥样品总蛋白SDS-PAGE图谱Fig.2 SDS-PAGE of total proteins in composting samples

1.7 蛋白质鉴定

MS/MS检索采用Mascot (http://www.matrixscience.com)搜索蛋白质数据库SwissProt2013 xyzzy (539 616 sequences；191 569 459 residues)，搜索参数见表1. 所有蛋白质以BLASTP人工注释，记录最相似的蛋白质名称和来源微生物.

表1 蛋白质数据库搜索参数

2 结果与分析

2.1 微生物群落差异性分析

接菌组和对照组2个处理中共鉴定到 1 022个蛋白，其中，接菌组499个蛋白(435个细菌蛋白和 64个真菌蛋白)，对照组523个蛋白(338个细菌蛋白和185个真菌蛋白). 细菌蛋白主要来源于Gammaproteobacteria纲(相对丰度为46.2%～56.8%)、Bacilli纲(相对丰度为6.4%～16.0%)和Betaproteobacteria纲(相对丰度为5.3%～11.5%)，真菌蛋白主要来源于Saccharomycetes纲(相对丰度为26.6%～48.1%)和Eurotiomycetes纲(相对丰度为10.8%～32.8%)(见图3). 为了研究群落组成的差异性，Gammaproteobacteria纲细菌又被分成Pseudomonadales目、Enterobacteriales目和other Gammaproteobacteria纲. 与对照组相比，接菌组中Pseudomonadales目细菌占比由15.1%升至27.6%，Bacilli纲细菌占比由16.0%降至6.4%，Eurotiomycetes纲真菌占比由10.8%升至32.8%，Saccharomycetes纲真菌占比由48.1%降至26.6%.

图3 细菌和真菌群落组成和相对丰度Fig.3 Bacterial and fungal community composition and relative abundance in the metaproteome

分析结果显示，添加菌剂使堆肥系统中的微生物群落发生了一定改变，细菌中Bacilli纲的数量减少，成为次要群落，但在菌剂中Bacilli纲是主要微生物群落，即菌剂中的优势菌群进入堆肥系统后，非但没有巩固Bacilli纲的优势地位，反而使之退化为次要群落. 在真菌中，Eurotiomycetes纲的数量增加，成为优势菌群，而微生物菌剂中的优势菌群Aspergillus属正是属于Eurotiomycetes纲.

2.2 碳水化合物代谢功能差异性分析

碳水化合物代谢是堆肥过程中的主要代谢类型. 在接菌组和对照组中共检测到146个与碳水化合物代谢相关的蛋白(见表2)，占全部蛋白质的14.3%. 在接菌组中，碳水化合物酶主要来源于Pseudomonadales目(17个)和Enterobacteriales目细菌(12个)、Actinobacteria纲放线菌(6个)、Eurotiomycetes纲真菌(9个)，数量均多于对照组，而对照组中碳水化合物酶来源于Bacilli纲细菌(10个)和Saccharomycetes纲真菌(12个). 结果表明，微生物菌剂增强了Gammaproteobacteria纲细菌的功能，尤其是Pseudomonadales目和Enterobacteriales目细菌的功能，以及Actinobacteria纲细菌和Eurotiomycetes纲真菌的功能，抑制了Bacilli纲细菌和Saccharomycetes纲真菌的功能. Pseudomonadales目细菌和Eurotiomycetes纲真菌在功能上取代了Bacilli纲细菌和Saccharomycetes纲真菌而成为了优势群落.

表2 堆肥样品中检测到的碳水化合物酶

木质纤维素的降解在堆肥过程中起到关键作用，纤维素和半纤维素是堆肥中的主要碳源，为生物转化提供能量，而木质素是腐植酸形成过程中重要的起始物质[20]. 在接菌组和对照组中共鉴定到9种木质纤维素酶，接菌组中Thermobifida属放线菌产纤维素酶(1个)，Aspergillus属(Eurotiomycetes纲)真菌产纤维素酶(4个)和半纤维素酶(1个)，Melanocarpus属(Sordariomycetes纲)真菌产木质素酶(1个)，对照组中Bacillus属(Bacilli纲)细菌产纤维素酶(1个)，Aspergillus属真菌产半纤维素酶(1个)(见表3). Eurotiomycetes纲的Aspergillus属真菌是堆肥过程中降解木质纤维素的主要微生物，添加菌剂增强了其分泌纤维素酶的能力. 添加菌剂也增强了木质素的分解作用，但是由于腐殖酸的形成不需要木质素完全分解，所以产木质素酶的微生物没有成为优势群落. Sánchez[21]研究表明，Basidiomycota门真菌是最高效的木质素降解功能微生物，但是笔者在试验中并没有检测到Basidiomycota门真菌产木质素酶，而且Basidiomycota门的真菌蛋白占比仅为4.7%～4.9%(见图3). 在木质纤维素降解过程中Basidiomycota门的真菌在丰度和活性上均不占优势.

2.3 碳水化合物代谢途径分析

表3 堆肥样品中检测到的木质纤维素酶

如图4所示，堆肥过程中的碳水化合物代谢途径主要包括纤维素降解(Cellulose degradation)、木质素降解(Lignin degradation)、半纤维素降解(Hemicellulose degradation)、淀粉和蔗糖代谢(Starch and sucrose metabolism)、糖酵解(Glycolysis)、丙酮酸代谢(Pyruvate metabolism)、三羧酸循环(TCA cycle)、乙醛酸循环(Glyoxylate cycle)、磷酸戊糖途径(Pentose phosphate pathway)、氨基糖和核苷酸糖代谢(Amino sugar and nucleotide sugar metabolism)、丙酸代谢(Propanoate metabolism)、丁酸代谢(Butanoate metabolism)、磷酸肌醇代谢(Inositol phosphate metabolism).

堆肥过程中细菌和真菌最关键的功能是产生纤维素酶[20]. 降解纤维素需要3种类型的酶，即内切葡聚糖酶(Endoglucanase)、外切葡聚糖酶(Exoglucanase)和β-葡糖苷酶(β-glucosidase)[20,22]. 接菌组中检测到内切葡聚糖酶(图4中酶1，下同)和β-葡糖苷酶(酶2)，而在对照组中仅检测到内切葡聚糖酶. 内切葡聚糖酶能将可溶性纤维素水解成还原性寡糖，但是过量的水溶性寡糖尤其是纤维二糖会抑制纤维素酶的表达和活性，影响纤维素的降解[23]. β-葡糖苷酶可以将纤维二糖水解成葡萄糖以消除这种抑制作用[22]. 因此，接菌组中的纤维素在堆肥过程中获得了有效降解. 在接菌组中检测到一种木质素降解酶——漆酶(Laccase). 漆酶是一组对双酚蓝铜氧化酶，它对木质素的降解机制尚不清楚，而且一些降解木质素的真菌并不产生漆酶，说明在降解木质素的过程中漆酶并不是必要的，但是毫无疑问在产生漆酶的白腐菌对木质素的分解过程中，漆酶也起着重要的作用[24]. Eggert等[25-27]发现，红栓菌(Pycnoporuscinnabarinus)仅产生漆酶作为唯一的分解木质素的酶，并且提出了一种新的木质素聚合物降解系统.

注： 仅在接菌组发现的酶用红色高亮数字序号表示，仅在对照组发现的酶用蓝色高亮数字序号表示，在接菌组和对照组都存在的酶用绿色高亮数字序号表示.1—内切葡聚糖酶； 2—β-葡糖苷酶； 3—漆酶； 4—D-木糖还原酶； 5—D-木酮糖激酶； 6—1,4-α-葡聚糖分支酶； 7—葡萄糖-1-磷酸腺苷酰基转移酶； 8—1,3-β-葡聚糖合酶； 9—葡萄糖-6-磷酸异构酶； 10—6-磷酸果糖激酶； 11—果糖二磷酸醛缩酶； 12—磷酸丙糖异构酶； 13—甘油醛-3-磷酸脱氢酶； 14—磷酸甘油酸激酶； 15—依赖2,3-磷酸甘油酸的磷酸甘油酸变位酶； 16—烯醇酶； 17—磷酸烯醇丙酮酸羧激酶； 18—磷酸烯醇丙酮酸羧化酶； 19—果糖-1,6-二磷酸酯酸； 20—丙酮酸脱氢酶； 21—丙酮酸脱氢酶； 22—乙醛脱氢酶； 23—磷酸乙酰转移酶； 24—丙酮酸磷酸双激酶； 25—丙酮酸羧化酶； 26—柠檬酸合酶； 27—乌头酸水合酶； 28—异柠檬酸脱氢酶； 29—2-酮戊二酸脱氢酶； 30—琥珀酰辅酶A连接酶； 31—琥珀酸脱氢酶； 32—苹果酸脱氢酶； 33—异柠檬酸裂合酶； 34—苹果酸合酶； 35—6-磷酸葡糖酸脱氢酶； 36—转醛醇酶； 37—磷酸戊糖变位酶； 38—磷酸葡萄糖胺变位酶； 39—UDP-葡萄糖-6-脱氢酶 40—异丙醇脱氢酶； 41—丙酮醛合酶； 42—2-柠檬酸甲酯合成酶； 43—乙酰乙酰辅酶A还原酶； 44—肌糖-2-脱氢酶； 45—磷脂酰肌醇-4-激酶.图4 微生物群落的碳水化合物代谢路径图Fig.4 Depiction of the carbohydrate metabolic characteristics of microbial communities inferred from the metaproteome

餐厨垃圾中含有大量易降解的碳水化合物，这些物质降解产生的有机酸使堆肥初期pH下降，影响其他有机物的降解[8]. 有报道称餐厨垃圾中最主要的有机酸是乙酸和乳酸[28]，但是笔者在该研究中并没有检测到与乳酸产生相关的酶，这可能是因为堆肥过程是在反应器中进行，通风条件较好，堆体中氧气含量较高，抑制了乳酸菌的生长. 在接菌组中，乙酸、丙酸、丁酸分别进入丙酮酸代谢、丙酸代谢和丁酸代谢途径. 丙酮酸代谢中，乙酸主要是由乙醛(Acetaldehyde)在乙醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase，酶22)催化下生成，然后在磷酸乙酰转移酶(Phosphate acetyltransferase，酶23)等的催化下转变成乙酰CoA，之后可能进入乙醛酸循环[29]. 乙醛脱氢酶主要由Actinobacteria纲放线菌产生，磷酸乙酰转移酶主要由Enterobacteriales目细菌产生. 丙酸代谢中，丙酰辅酶A (Propanoyl-CoA)在2-甲基柠檬酸合酶(2-methylcitrate synthase，酶42)催化下生成2-甲基柠檬酸(2-Methyl-citrate)，2-甲基柠檬酸经过一系列反应生成琥珀酸(Succinate)进入三羧酸循环[30]. 2-甲基柠檬酸合酶主要由Eurotiomycetes纲真菌产生. 丁酸代谢中，乙酰乙酰辅酶A (Acetoacetyl-CoA)在乙酰辅酶A还原酶(Acetoacetyl-CoA reductase，酶43)催化下生成3-羟基丁酰辅酶A (3-Hydroxy-butanoyl-CoA)[31]，3-羟基丁酰辅酶A参与丁酸的生成，也可以生成琥珀酰辅酶A (Succinyl-CoA)进入三羧酸循环. 乙酰辅酶A还原酶主要由Pseudomonadales目细菌产生.

总的来说，接菌组中微生物活性较高，存在多种小分子有机酸的代谢途径，防止了有机酸的积累；而在对照组中，有机酸代谢途径单一，有机酸积累使pH下降，又会进一步抑制微生物的活性，影响其他有机物的降解.

3 讨论

近年来在国际上堆肥微生物接种剂的研究较多，但是对于其应用效果的结论尚不统一. 有些观点认为，人工接种的微生物功能单一，无法与大量的土著微生物竞争. 为了阐明接种剂与堆肥土著微生物的相互作用，该研究采用宏蛋白质组学方法，从分子生物学角度展开分析. 该研究所使用的菌剂主要由芽孢杆菌(Bacillales目)和曲霉(Aspergillus属)组成. 添加菌剂后，堆肥中产木质纤维素酶的真菌增多，这可能是由于堆肥系统中缺乏木质纤维素分解菌，而菌剂中的曲霉是典型的木质纤维素降解菌[32]，因此能够适应堆肥环境. 而菌剂中的芽孢杆菌可能不具备分解纤维素的能力，只起到稳定菌剂体系、提供生长因子等作用，因此，进入堆肥系统后，其功能不被系统所需要，无法与土著微生物竞争(见图5).

餐厨垃圾堆肥系统所需要的功能除了分解木质纤维素以提供碳源以外，还有促进小分子有机酸的转化以维持堆体酸碱平衡的功能. 对照组中，由于酵母菌(Saccharomycetes纲)能够在酸性条件下生长，可能起到调节酸性环境、促进嗜热菌生长的作用[33]，因此成为了优势菌群. 添加菌剂后，假单胞菌(Pseudomonadales目)、肠杆菌(Enterobacteriales目)、放线菌(Actinobacteria纲)、散囊菌(Eurotiomycetes纲)的碳水化合物代谢活性增强，尤其是乙酸、丙酸和丁酸的转化增强. 虽然肠杆菌和放线菌的相对丰度没有发生明显变化，但是由于假单胞菌和散囊菌在小分子有机酸和木质纤维素代谢中具有重要作用，取代了土著的酵母菌和芽孢杆菌(Bacilli纲)，在相对丰度和功能上都成为了优势菌群.

宏蛋白质组学方法受数据库分析的影响很大，数据库的选择影响了分析的广度、深度以及结果的稳定性. 目前国际上的蛋白质数据库较多，但是缺乏专门的堆肥微生物蛋白质数据库，因此该研究选择了信息覆盖较广的NCBI数据库进行蛋白质的功能注释. 笔者相信，随着堆肥相关数据库的建立，宏蛋白质组学方法能够提供一个更加深入的视角来了解堆肥过程的分子细节，探究堆肥微生物功能演替规律.

4 结论

a) 微生物菌剂能否发挥作用，取决于菌剂是参与易降解有机物还是难降解有机物的新陈代谢作用. 堆肥系统中缺乏分解木质纤维素等难降解有机物的微生物，接种木质纤维素分解菌就会与土著菌形成协同增效；当堆肥中由于小分子有机酸积累产生酸性环境时，能够转化有机酸的微生物群落之间就会发生竞争.

b) 堆肥土著微生物之间不是统一的整体，群落之间也存在竞争与演替，因此只要选择好菌剂的功能，掌握正确的接种时机，微生物菌剂就能够发挥原有的作用.

c) 宏蛋白质组学技术是研究堆肥复杂环境下微生物相互作用的有效手段，为微生物菌剂的应用、促进堆肥腐植化进程、提高堆肥产品品质提供了新的视角.