安五脂素对衰老小鼠抗疲劳作用研究

刘嘉玮,张馨芸,林慧娇,苑丽葳,刘佳乐,王春梅,孙靖辉,张成义,陈建光,李 贺,敬 舒

(1.北华大学药学院,吉林吉林 132013;2.吉林市中心医院,吉林吉林 132013;3.北华大学附属医院,吉林吉林 132013)

我国正处于人口老龄化的高潮期,面临着十分严峻的老龄化形势[1]。衰老是机体生命过程中不可避免的现象,是指生物在发育成熟后,机体组织器官随着时间推移,功能逐渐衰退的过程[2-3]。衰老过程中,神经肌肉系统的机能显著下降,机体会逐渐出现力量下降、运动耐力下降等疲劳表现,对生活质量影响较大[4]。因此,研发具有抗衰老及抗疲劳的药物和保健食品将对提高老龄人口的生活质量具有十分重要的意义[5]。

南五味子也称华中五味子,是木兰科植物五味子的干燥成熟果实,具有收敛、滋补、保肝、抗癌、抗氧化等活性,是药物和保健食品开发的理想资源[6]。安五脂素(Anwulignan,AN)是南五味子木脂素中具有代表性的单体活性成分,但关于其功效研究较少,目前仅有研究报道其对血小板聚集有一定的抑制作用[7],含安五脂素的中药制剂五酯片对肝功能具有改善作用[8]。在本研究前期工作中发现,安五脂素对D-半乳糖所致亚急性衰老小鼠的肝脏具有显著的保护作用[9],显示出较好的抗衰老活性。但关于其对衰老小鼠运动耐力及疲劳相关血清尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)、乳酸(Lactic acid,LD)、乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)的含量的影响未见报道。

因此,本研究应用D-半乳糖诱导的小鼠亚急性衰老模型以观察安五脂素的抗疲劳作用,以期为开发抗衰老和抗疲劳药物及保健食品提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

安五脂素 由四川省维克奇生物科技有限公司提供;BUN、LD、LDH、CK、超氧化物酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒 由南京建成生物工程研究所提供;雄性ICR小鼠40只(合格证号:SCXK(吉)2019-0004) 由长春亿斯实验动物技术有限公司提供。

YLS-13A型大小鼠抓力测定仪 由成都泰盟软件有限公司提供;YLS-4C型小鼠疲劳转棒仪 由上海软隆科技发展有限公司提供;ChampChemi 500型全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统 由北京赛智创业科技有限公司提供;全自动酶标仪 由瑞士TECAN集团公司提供。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及给药 将小鼠随机分为空白对照组(CON)、模型组(MOD)、低剂量AN组、高剂量AN组。CON组、MOD组给予0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液10 mg/kg灌胃,AN低剂量组和高剂量组分别给予1，4 mg/kg的AN灌胃。除CON组皮下注射生理盐水外,其他组均皮下注射D-半乳糖(220 mg/kg)。每日一次,持续6周。

1.2.2 小鼠疲劳转棒实验 于末次给予药物60 min之后,进行疲劳转棒实验(转速30 r/min)。在进行正式实验前,提前进行3次适应性训练,然后记录小鼠从转棒上跌落的时间。

1.2.3 小鼠前肢握力实验 于末次给予药物60 min之后,进行小鼠前肢握力的实验。根据小鼠喜用爪抓物的习性[10],应用前肢握力测试仪,对各组小鼠进行前肢握力测试,将小鼠可接受的最大张力作为其前肢握力。

1.2.4 小鼠体内疲劳相关的生化指标检测 于末次给予药物60 min之后,麻醉,眼球采血后3000 r/min离心10 min制备血清,取骨骼肌生理盐水漂洗后,以备用。检测血清中BUN、LD、LDH、CK的水平。

1.2.5 小鼠体内氧化相关生化指标检测 取上述制备的骨骼肌组织,参照相应试剂盒所提供的检测方法来检测SOD活力和MDA的含量。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 安五脂素对小鼠运动耐力的影响

转棒实验和前肢握力实验被广泛用于评估动物的体力和疲劳程度[11-12]。如图1A所示:转棒实验中,与CON组相比,MOD组转棒停留时间极显著缩短(P<0.01);与MOD组相比,An-H组小鼠转棒时间显著增加(P<0.05)。前肢握力实验结果如图1B所示:与CON组相比,MOD组小鼠前肢握力极显著缩短(P<0.01);与MOD组相比,An-L组小鼠和An-H组小鼠前肢握力显著增加(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素能够增强D-半乳糖致衰老小鼠的运动耐力。

图1 安五脂素对小鼠运动耐力的影响(Mean±SD,n=10)Fig.1 Effects of anwulignan on exercise endurance in mice(Mean±SD,n=10)注:A:疲劳转棒实验;B:前肢握力实验。#表示与CON组相比,P<0.05;##表示与CON相比,P<0.01;*表示与MOD组相比,P<0.05,**表示与MOD组相比,P<0.01；图2～图3同。

2.2 安五脂素对小鼠疲劳相关生化指标含量的影响

2.2.1 安五脂素对小鼠血清BUN含量的影响 BUN是蛋白质的代谢产物,同时是体力负荷时承受能力的指标,其含量反映了蛋白质分解代谢和身体对运动的耐受性[13-14]。在本研究中,小鼠血清BUN含量检测结果显示图2A,与CON组相比,MOD组小鼠BUN含量显著升高(P<0.05),与MOD组相比,An-H组小鼠BUN含量显著下降(P<0.05)。提示AN可以降低血清BUN含量,增强D-半乳糖致衰老小鼠的运动耐受性。

图2 安五脂素对小鼠体内疲劳相关生化指标活性及含量的影响(Mean±SD,n=10)Fig.2 Effects of anwulignan on fatigue-related biochemical indexes in mice(Mean±SD,n=10)注:A：BUN;B：LD;C:LDH;D：CK。

2.2.2 安五脂素对小鼠血清LD含量的影响 LD水平是对机体有氧代谢能力和疲劳程度的反映,机体长时间大量运动会使血液中乳酸的浓度升高,乳酸堆积的越多疲劳的程度就越严重[15]。在运动的过程中,有氧能量供应变为肌肉中的无氧糖酵解,产生大量的LD,LD在肌肉和血液中的累积会导致肌肉疲劳[16-18]。对各组小鼠血清LD活性检测结果显示图2B,与CON组相比,MOD组小鼠LD含量极显著升高(P<0.01),与MOD组相比,An-L组An-H组小鼠血清LD含量显著下降(P<0.05)。提示安五脂素可以降低血清LD含量,缓解D-半乳糖致衰老小鼠的疲劳程度。

2.2.3 安五脂素对小鼠血清LDH含量的影响 血清中LDH的量反映机体运动肌肉损伤的程度。当肌肉受损时细胞破裂,LDH释放入血使其在血液中的活性升高[19-20]。对各组小鼠血清LDH活性检测结果显示图2C,与CON组相比,MOD组小鼠血清中LDH活性极显著升高(P<0.01),与MOD组相比,An-L组和An-H组小鼠血清LDH活性显著下降(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素可以降低血清LD含量,缓解D-半乳糖致衰老小鼠肌肉损伤程度,显示出抗疲劳作用。

2.2.4 安五脂素对小鼠血清CK含量的影响 CK是判定肌肉损伤的另一重要指标,在一定程度反映了机体的运动耐力[21]。对各组小鼠血清CK含量检测结果显示图2D,与CON组相比,MOD组小鼠血清CK含量显著升高(P<0.05);与MOD组相比,An-H组小鼠血清CK含量显著降低(P<0.05),进一步证明安五脂素对D-半乳糖致衰老小鼠具有抗疲劳作用。

2.3 安五脂素对小鼠骨骼肌氧化相关生化指标含量的影响

2.3.1 安五脂素对小鼠骨骼肌SOD活性的影响 在缓解疲劳的过程中,SOD是人体中最主要的抗氧化酶,发挥着保持体内氧化和抗氧化平衡的作用[22-23]。在本实验中,对各组小鼠骨骼肌中SOD活性检测结果见图3A,与CON组相比,MOD组小鼠SOD活性极显著下降(P<0.01);与MOD组相比,An-L组和An-H组小鼠SOD活性显著升高(P<0.05或P<0.01)。提示安五脂素可能通过增加SOD活性,增强抗氧化能力而发挥对D-半乳糖致衰老小鼠抗疲劳作用。

2.3.2 安五脂素对小鼠骨骼肌MDA含量的影响 MDA是脂质过氧化的产物,是评价机体抗氧化能力的重要参数,能间接反映组织中过氧化损伤的程度[24-25]。对各组小鼠骨骼肌中MDA含量结果显示图3B,与CON相比,MOD组小鼠MDA含量显著升高(P<0.05);与MOD组相比,An-H组小鼠骨骼肌中MDA含量显著下降(P<0.05)。提示安五脂素减轻了D-半乳糖致衰老小鼠鼠骨骼肌的氧化损伤,这可能是安五脂素发挥抗疲劳作用的主要机制之一。

图3 安五脂素对小鼠体内氧化相关生化指标的影响(Mean±SD,n=10)Fig.3 Effect of anwulignan on oxidation-related biochemical indicators in mice(Mean±SD,n=10)注：A:SOD;B:MDA;#:与CON组相比,P<0.05;##:与CON相比,P<0.01;*与MOD组相比,P<0.05,**与MOD组相比,P<0.01。

3 讨论与结论

我国已进入老龄化国家行列,衰老伴有的疲劳已成为影响老年人生活质量的主要问题之一[26-27]。因此研发能够延缓衰老同时抑制疲劳的药物和保健食品将具有广阔的市场前景和深远的社会效益。本研究通过观察安五脂素对D-半乳糖所致衰老小鼠运动耐力及疲劳相关生化指标的影响,首次明确了安五脂素对小鼠衰老所致疲劳的抑制作用,为开发抗疲劳和衰老药物和保健食品提供了理论依据。

D-半乳糖诱导亚急性衰老动物模型是经典的衰老模型构建方法。与其他相关报道完全一致,本研究在连续皮下注射D-半乳糖后,运动耐力和疲劳相关生化指标均显示小鼠呈现疲劳状态[28-29]。而给予安五脂素后,小鼠疲劳转棒及前肢握力实验结果显示运动耐力增强,表现出显著的抗疲劳作用。为进一步明确安五脂素的抗疲劳作用,本研究对小鼠血清BUN、LD、LDH及CK等评估机体疲劳程度最经典指标进行观察。研究结果显示,安五脂素能够降低D-半乳糖所致衰老小鼠血清中上述生化指标水平,进一步证实了安五脂素对衰老小鼠具有抗疲劳作用。

衰老时骨骼肌氧自由基与体内自由基清除系统平衡状态被打破,ROS产生过多,骨骼肌产生氧化应激损伤[30-31]。本研究结果显示,安五脂素可以提高小鼠骨骼肌中SOD的活性,降低MDA含量,这与前期研究中安五脂素对D-半乳糖致衰小鼠肝组织中SOD及MDA水平的影响是完全一致的[9]。提示安五脂素可能通过显著的抗氧化作用发挥抗疲劳及抗衰老作用。Nrf2/ARE是机体抗氧化作用的关键调节通路,前期研究中发现,安五脂素可以激活衰老小鼠肝及脑组织中Nrf2/ARE通路相关蛋白[9]。因此推测,安五脂素在本研究中所显示的抗疲劳作用也可能与Nrf2/ARE通路有关,具体相关机制将在后续实验中深入探讨。

本研究依据前期实验结果选用低(1 mg/kg)、高(4 mg/kg)两个剂量对安五脂素的抗疲劳作用进行观察。研究结果显示,4 mg/kg 安五脂素对运动耐力及疲劳、氧化等全部测定指标均具有显著影响,而1 mg/kg对BUN、CK、MDA等指标的影响无统计学差异,提示安五脂素对D-半乳糖所致衰老小鼠的抗疲劳作用可能与剂量相关,其具体的剂量效应关系将在后续的研究中进行观察。

综上,安五脂素对D-半乳糖致衰老小鼠具有显著的抗疲劳作用,该作用可能与其发挥抗氧化活性有关。