HOXA-AS3通过调控HOXA6/7基因对人肺腺癌细胞增殖凋亡作用机制

张超 曲晓翰 韩立波

中国医科大学附属第一医院（沈阳110001）

肺癌（lung cancer）是支气管黏膜上皮细胞发生病变所导致的恶性肿瘤［1］，既是最常见的恶性肿瘤，同时也较难治愈［2］。在中国，肺癌已经成为恶性肿瘤致死的最主要原因［3］。由于现代工业和经济的不断发展，在吸烟、可吸入颗粒物增加以及巨大社会心理压力等的作用下，肺癌的发病率不断上升［4］。尽管目前我国肺癌男性发病率高于女性，但近年来由于烹饪油烟等的危害，导致女性发病率也在逐年攀升［5］。按照不同的组织病理学特征及生物学行为，肺癌可分为腺癌、大细胞癌和鳞癌等类型［6-7］。其中，肺腺癌（lung adenocarcinoma）已经成为目前肺癌发病率较高，同样也是较难治愈的一种类型。大部分肺腺癌在检出时就处于中晚期［8］，手术不能完全治愈，因此患者还需要辅助放化疗等其他治疗方法。但该病对放化疗接受力较差，因此没有特别有效的治疗方法，导致肺腺癌的预后通常较差［9］。尽管许多学者对肺腺癌已经进行了大量的临床实验研究，但肺腺癌的发病机理仍不明确［10］。因此，寻找该病的发病原因，探究在该病的发生发展过程中细胞内基因和蛋白的表达关系，有望成为预防和治疗肺腺癌的有效途径，并对今后医学领域中肺腺癌的研究起到重要促进作用［11-12］。近年研究［13-14］发现HOX 基因在哺乳动物中均有表达，其含有183 个核苷酸序列并具有严密保守性。大量研究［15-16］表明，HOX 基因在多种肿瘤中都有表达，并调节细胞的增殖与迁移并对DNA 合成和转录过程起关键的调控作用。位于染色体7p15-p14 上的HOXA6/7 所编码的蛋白质能识别特定的DNA 序列进而调控肿瘤细胞的增殖与迁移［17-19］。因此，本文通过TUNEL 法、CCK-8 法、划痕实验、Western blot 法及RT-PCR 法分析单纯人肺腺癌细胞株与HOXA-AS3 转染的人肺腺癌细胞株之间细胞凋亡、增殖、迁移能力、HOXA6/7 蛋白表达及HOXA6/7 mRNA 表达的差异，研究HOXAAS3 通过调控HOXA6/7 基因对人肺腺癌细胞增殖凋亡的作用机制，为实现控制肺腺癌的发展与转移提供临床帮助。

1 材料与方法

1.1 细胞分组与培养将ATCC 细胞库购买的人肺腺癌细胞株在含10%胎牛血清的DMEM 培养液中与孵育箱中（37 ℃，5%CO2）培养。细胞密度达到80% ～90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化细胞。经800 r/min 离心5 min 后收集细胞并加入培养基中继续培养，重悬细胞，按13 传代。待细胞生长至80%左右，随机分为2 组：第1 组为对照组（LA组，单纯人肺腺癌细胞株），第2 组为实验组（EX组，HOXA-AS3 转染的人肺腺癌细胞株）。

1.2 实验仪器与试剂台式高速离心机（德国HETTICH）；细胞培养瓶（美国Corning）；酶标仪（美国Bio-Rad）；荧光显微镜（日本Olympus）；倒置相差显微镜（日本Olympus）；PCR 电泳仪（济南九宏公司）；逆转录试剂盒（上海酶联公司）；恒温摇床（成都苏净器材公司）等。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞转染将HOXA-AS3 溶于49 μL 无血清培养基中混匀，温育5 min。将肺腺癌细胞稀释至2×105/mL，平铺到24 孔板中。待肺腺癌细胞密度生长至70% ～80%时，将稀释的肺腺癌细胞加入培养皿中转染4 h 左右。随后弃去上层液体，更换培养基，继续培养48 h。

1.3.2 TUNEL 法检测肺腺癌细胞凋亡情况将不同组份的细胞进行低温低速离心（2 000 r/min，4 ℃）5 min 后，对贴壁细胞用0.25%不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后再离心收集并按TUNEL 试剂盒说明书进行标记染色。每张切片随机选取视野，使用显微镜（SP×400）观察每个视野的细胞凋亡数量。

1.3.3 CCK-8 法检测肺腺癌细胞增殖情况配置浓度为5 × 105/mL 的细胞悬液，分别接种于96 孔板中（100 μL/孔），放入孵育箱中于37 ℃培养24 h，随后加入10 μL 的CCK-8 溶液继续孵育4 h。使用酶标仪测定450 nm 处的吸光度（OD值）。

1.3.4 划痕实验检测肺腺癌细胞迁移能力配置200 μL 浓度为5 × 105/mL 的细胞悬液，加入0.05%胰蛋白酶并置于不含血清的DMEM 培养基中。稀释至5 × 102个/孔后接种于6 孔板中。等细胞附着于壁后，用20 μL 枪头均匀刮划，并使用PBS（pH 7.4）洗涤3 次。随后在培养液中培养24 h，使用显微镜（SP × 100）记录细胞运动的距离。

1.3.5 Western blot 法检测肺腺癌细胞中HOXA6/7 蛋白表达配置200 μL 浓度为5 × 105/mL 的细胞悬液，加入0.25%胰蛋白酶后加RIPA裂解液，冰浴，离心，取上层液体。使用SDSPAGE 电泳分离后转至PVDF 膜，加5%脱脂奶粉，密封1 h，用BCA 法检测蛋白浓度。加入一抗GAPDH（1∶5 000）培育24 h，培育后取出并用PBS（pH 7.4）洗涤，随后加入二抗（1∶12 000），在室温、无光的条件下培育1 h。HOXA6/7 蛋白表达量使用QuantityOne 软件进行分析。

1.3.6 RT-PCR 法检测肺腺癌细胞中HOXA6/7 mRNA 表达在细胞中加入氯仿，经摇荡、离心，使溶液呈乳白状。随后在4 ℃下12 000 r/min 离心并加入异丙醇。再次离心后加75%乙醇。最后离心、干燥并于-80 ℃保存。反转录体系使用表1的引物序列，设计为94 ℃处理10 min，94 ℃处理15 s，60 ℃处理34 s，72 ℃处理30 s 以及72 ℃处理10 min，重复40 次并计算HOXA6/7 mRNA 表达量。

PCR 反应结束后，配置2%琼脂糖凝胶，避光放置1 h，然后依次向每孔中加入各个PCR 产物5 μL，在180 V 电压下电泳，使溴酚蓝与起始点完全分开后结束电泳，将凝胶放置在成像仪下观察并采集凝胶电泳数据。

1.4 统计学方法使用SPSS 22.0 软件分析LA组、EX 组之间肺腺癌细胞凋亡、增殖、迁移能力、HOXA6/7 蛋白表达及HOXA6/7 mRNA 表达的差异，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TUNEL 法检测肺腺癌细胞凋亡情况经TUNEL 染色，LA 组肺腺癌细胞凋亡较多、分布明显稀疏，EX 组肺腺癌细胞凋亡数量较少、细胞凋亡率明显下降（P＜0.05）。见图1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.2 CCK-8 法检测肺腺癌细胞增殖情况组间比较表明LA 组和EX 组之间的OD值差异有统计学意义，EX 组肺腺癌细胞的增殖数量较多，LA 组肺腺癌细胞的增殖数量较少，EX 组肺腺癌细胞的增殖明显高于LA 组（P＜0.05），见图2。

图1 两组肺腺癌细胞凋亡情况（SP，×400）Fig.1 Apoptosis of lung adenocarcinoma cells in two groups（SP，×400）

2.3 划痕实验检测肺腺癌细胞迁移能力细胞迁移实验检测肺腺癌细胞水平运动迁移能力的结果如图3所示，各组划痕24 h 后，LA 组肺腺癌细胞穿过Trangwell 小室的细胞数为（137.8 ±17.5），显示较宽无细胞区域，EX 组肺腺癌细胞穿过Trangwell 小室的细胞数为（39.2 ± 14.3），显示较窄无细胞区域，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 Western blot 法检测肺腺癌细胞中HOXA6/7蛋白表达使用Western blot 法对LA 组、EX 组肺腺癌细胞内HOXA6/7 蛋白的免疫印迹检测表明，LA 组的HOXA6/7 蛋白表达含量较低而EX 组的HOXA6/7 蛋白含量明显升高（均P＜0.05），见图4。HOXA6/7 的蛋白表达水平与肿瘤T 分期（P=0.028）、肿瘤临床分级（P= 0.029）及淋巴结转移（P= 0.012）均呈正相关，且肺腺癌细胞内的HOXA6/7 表达明显高于正常值时。

图2 两组肺腺癌细胞增殖情况Fig.2 Proliferation of lung adenocarcinoma cells in two groups

2.5 RT-PCR 法检测肺腺癌细胞中HOXA6/7 mRNA 表达RT-PCR 法检测肺腺癌细胞中HOXA6/7 mRNA 表达量的结果表明，LA 组肺腺癌细胞内的HOXA6/7 mRNA 表达量较低，EX 组肺腺癌细胞内的HOXA6/7 mRNA 表达量明显升高（均P＜0.05），见图5。HOXA6/7 蛋白主要在细胞核内表达且在癌组织中的表达明显高于癌旁正常肺组织，表明HOXA6/7 在肺腺癌组织中的异常高表达状态可能与肿瘤进展密切相关，可参与肺腺癌发生、发展的调节。

图3 两组肺腺癌细胞的迁移能力（SP，×100）Fig.3 Migration ability of two groups of lung adenocarcinoma cells（SP，×100）

3 讨论

图4 两组肺腺癌细胞内的HOXA6/7 蛋白表达Fig.4 Expression of HOXA6/7 protein of lung adenocarcinoma cells in two groups

图5 两组肺腺癌细胞内的HOXA6/7 mRNA 表达Fig.5 Expression of HOXA6/7 mRNA of lung adenocarcinoma cells in two groups

HOX 基因家族在胚胎发育以及癌症的发生发展中起到了至关重要的作用［20］，作为一种嵌入HOX 基因簇的长链非编码RNA，越来越多的研究表明HOXA-AS3 可能与多种肿瘤的进展相关。WU 等［21］通过高通量测序筛选出HOXA-AS3 在神经胶质瘤组织中的表达量显著上调，并探讨了其对胶质瘤细胞生物行为学功能的影响从而开启了HOXA-AS3 在实体肿瘤中的研究序幕。很快，有学者证实HOXA-AS3 参与了肝细胞癌［22］、胰腺癌［23］、口腔癌［24］的发生发展。在非小细胞肺癌领域，有研究表明HOXA-AS3 在肿瘤组织及细胞系中的转录水平显著高于癌旁组织及正常支气管上皮细胞，但其对非小细胞肺癌细胞的调控及具体机制尚不明确。

本研究通过TUNEL 实验、CCK-8 实验、划痕实验证实上调HOXA-AS3 可显著抑制肺腺癌细胞凋亡并促进其增殖与迁移能力。作为非编码RNA 中的一种反义转录本，HOXA-AS3 可通过与相邻基因的mRNA 形成双链RNA 进而保护相邻基因mRNA 免受核糖核酸酶的降解，增强其稳定性［25-26］。前期有研究表明在肿瘤组织中HOXA-AS3的表达与其临近编码基因HOXA6/7 mRNA 表达水平呈显著正相关。笔者在肺腺癌细胞中上调HOXA-AS3，发现HOXA6/7 基因的转录及蛋白表达水平随之升高。这些结果表明HOXA-AS3 对肺腺癌细胞生物行为学的影响是通过调控HOXA6/7来实现的。但HOXA-AS3 对HOXA6/7 的调控机制目前尚未完全阐明，是否也是基于与HOXA6/7 mRNA 形成双链并增强其稳定性，这些将是笔者下一步研究的重点。

综上所述，本研究表明lncRNA HOXA-AS3 可以通过调节HOXA6/7 进而促进肺腺癌细胞的恶性生物学行为。对其分子机制的深入研究可能给我们提供了一个治疗肺腺癌的潜在靶点，进而为控制肺腺癌的发展与转移提供临床帮助。