胡萝卜1个新4CL基因的克隆、进化及表达分析

罗庆 钟秀来 卢松

摘要：胡萝卜（Daucus carota L.）在NCBI（美国国家生物信息中心）上总共公布了13个4-香豆酰-CoA连接酶（4CL）基因，而在芹菜转录数据中发现1个4CL基因，利用该基因序列设计1对克隆引物，成功得到1个新胡萝卜4CL基因，命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp，编码544个氨基酸，位于胡萝卜基因组第2染色体上。进化树分析显示，Dc4CL-1基因聚集在与木质素合成有关的4CL Ⅰ亚族。实时荧光定量PCR转录表达发现，在胡萝卜根生长发育期间，Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达，而在栽培胡萝卜中低表达。推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素合成有关。

关键词：胡萝卜;4CL基因;克隆;进化;表达

中图分类号： S631.201  文献标志码： A  文章編号：1002-1302（2020）15-0089-06

胡萝卜（Daucus carota L.）是一种在全世界广泛栽培的、重要的根类蔬菜[1-2]。然而，高木质素含量会降低胡萝卜肉质根的口感和质量[3]。有研究表明，4-香豆酰-CoA连接酶（4-coumarate-CoA ligase，简称4CL）是苯丙烷类代谢途径的关键酶，是调控木质素和黄酮类代谢途径中的关键限速酶[4-6]。在植物体上，苯丙烷类代谢途径是一个非常重要的第2代谢途径;而hydroxycinnamate-CoA硫酯是木质素及其他重要苯丙烷类的前体物质[7-8]。

目前，胡萝卜基因组在NCBI（美国国家生物信息中心）上已公布、注释发表了13个4CL基因[9]。但是，在芹菜（Apium graveolens L.）转录组中发现有1个4CL基因已发表的胡萝卜4CL基因非常不同。因芹菜与胡萝卜同属伞形科家族，据进化树分析表明，胡萝卜与芹菜在分子水平上应具有高度相似性。因此，推测胡萝卜基因组中有可能存在新4CL基因。

本研究利用发现的芹菜4CL基因序列来设计引物，从野生胡萝卜贵野中克隆得到1个新4CL基因，命名为Dc4CL-1基因;并构建进化树，进行序列比对分析，预测其染色体定位等。实时荧光定量检测Dc4CL-1基因在整个胡萝卜根生长、发育过程中的表达水平。本试验进一步研究Dc4CL-1基因在胡萝卜根木质素合成中的作用，以期延伸其相关知识面及奠定相应的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生胡萝卜贵野收集于贵州省贵阳市，栽培于贵州省农业科学研究院园艺研究所种质资源圃，无明显的肉质根，且木质素含量很高;Kuroda是一种在亚洲广泛栽培的胡萝卜品种，有明显的肉质根，且木质素含量很低。将野生胡萝卜贵野和栽培胡萝卜Kuroda的种子播种于含蛭石混合物（土壤与蛭石体积比为3 ∶ 1）的塑料花盆中，置于人工气候箱中培养（昼、夜温度分别为25、22 ℃，光—暗周期为12 h—12 h，光照度为 3 000 lx）。于种子发芽后第3、5、8、20、40、60、90天时，分别将野生、栽培胡萝卜的根分离出来，立即用液氮处理，保存在-70 ℃冰箱中。

1.2 RNA提取及cDNA合成

采用RNA simple Total RNA kit试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司）提取样品中的总RNA，再用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的数量与质量，采用ND-1000分光光度计（Nanodrop Technologies，Inc.）进行总RNA的浓度测定，利用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis kit（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）将提取的总RNA反转录成一链cDNA。将cDNA稀释15倍，放在-20 ℃冰箱中保存，用于胡萝卜Dc4CL-1基因的克隆及实时荧光定量分析。

1.3 胡萝卜Dc4CL-1基因的克隆

根据芹菜Ventura转录组数据中的4CL基因序列，用Primer Primier 5软件设计胡萝卜Dc4CL-1基因的正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R）[10]。引物序列如下：Dc4CL-1F：5′-ATGGAGAAATCAGGGTACGGGAGAG-3′;Dc4CL-1R：5′-TCAGATTTTGGCTCTGACTTGCTC-3′。扩增PCR体系均为25 μL，反应条件为：98 ℃预变性5 min;98 ℃ 变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，34个循环;最后72 ℃延伸2 min。用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，用PCR提纯试剂盒提纯、再回收目的片段（诺唯赞生物科技股份有限公司）。回收后的目的片段连接到pMD19-T载体上，并转化到大肠杆菌（Escherich coli）DH5α上，随后进行质粒的酶切与鉴定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA测序。

1.4 序列比对和进化分析

将NCBI上获得的其他胡萝卜4CL蛋白序列与本研究克隆得到的序列用DNAMAN软件对所有序列进行多重比较分析。用MEGA 5软件分别通过邻接法（NJ）、最大简约法（MP）、最大似然法（ML）、最小进化法（ME）、非加权配对平均法（UPGMA）算法对胡萝卜4CL及其他物种的4CL蛋白序列构建进化树，并进行进化分析[11]。

1.5 实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量PCR采用高特异性染料法定量PCR检测试剂盒（AceQ qPCR SYBR Green Master Mix）（南京诺唯赞生物科技股份有限公司），按照操作说明进行，于荧光定量PCR仪StepOnePlusTM中进行3步法反应程序实时荧光定量PCR扩增，使用 2-ΔΔCT值法来分析该基因的相对表达水平。qPCR反应条件：95 ℃预变性 5 min;95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，95 ℃延伸 10 s，40个循环;熔点曲线为65～95 ℃，每 0.5 ℃ 增加1个梯度。DcActin1作为胡萝卜内参对照基因，其正向序列为5′-CGGTATTGTGTTGGACTCTGGTGAT-3′，反向序列为5′-CAGCAAGGTCAAGACGGAGTATGG-3′[12-13]。根据克隆到的Dc4CL-1基因序列用Primer Primier 5软件的设计定量引物（正向序列，5′-TCTCCCAACTCACTTCACTTCCC-3′;反向序列，5′-TTCAACATTTTCATCAAACCCCA-3′）。在非冗余蛋白序列（Nr）数据库中，利用BLASTn搜索得到分离的Dc4CL-1基因（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。qPCR-RT数据用IBM Statistics 20.0软件进行方差显著性分析（ANOVA），所有数据重复3次。

2 结果与分析

2.1 胡萝卜Dc4CL-1基因的序列分析

根据芹菜Ventura转录组数据中的4CL基因序列，设计1对正反引物序列（Dc4CL-1F和Dc4CL-1R），在野生胡萝卜贵野中成功扩增、克隆得到1个新4CL基因片段，命名为Dc4CL-1。Dc4CL-1基因长1 635 bp，编码544个氨基酸;而芹菜4CL基因长1 620 bp，编码539个氨基酸（图1、图2）。野生胡萝卜Dc4CL-1基因与芹菜4CL基因有89.79%的同质性（图1）。据胡萝卜基因组数据库结果显示，此基因位于胡萝卜基因组第2染色体上（GenBank：LNRQ01000002.1，区域：21 933 004～21 937 748，共4 745 bp），包含5个内含子和6个外显子。然而，本研究得到的胡萝卜Dc4CL-1基因的DNA全长4 749 bp，同样包含5个内含子和6个外显子（图3）[14]。结果还显示，此基因序列中包含完整的4CL保守结构域及AMP结合位点及CoA结合位点。此外BLASTp预测胡萝卜基因结果显示出，4CL蛋白是一种似4-香豆酰-CoA连接酶，同样Dc4CL-1蛋白属于AFD（adenylate forming domain）Ⅰ亚族（图3）。

2.2 Dc4CL-1蛋白的进化分析

本研究发现，在NCBI上共注释、公布了13个胡萝卜4CL基因，但是其中有2个4CL基因（GenBank：XM_01739850.1和XM_017398506.1）具有相同的开放阅读框（ORF）和氨基酸序列（XP_017253996.1和XP_017253995.1）。因此，舍弃前者（XP_017253996.1），将其他12个胡萝卜基因蛋白（GenBank：XP_017215228.1、XP_017215416.1、XP_017222125.1、XP_017229849.7、XP_017232211.1、XP_017234894.1、XP_017243044.1、XP_017244257.1、XP_017253062.1、XP_017253894.1、XP_017253995.1、XP_017258809.1）与芹菜及得到的胡萝卜Dc4CL-1蛋白一起构建进化树，进行进化关系分析。本研究运用MEGA 5软件对此14个蛋白用不同方法进行聚类分析，聚类结果如图4所示。进化树显示，Dc4CL-1、Ag4CL蛋白质及其中1个胡萝卜4CL蛋白质（XP_017253894.1）在5种不同进化分析方法下均位于同一分支上（图4，以方框标注出）。蛋白序列比对结果显示，Dc4CL-1蛋白质和其他物种的4CL蛋白质序列具有72.98%的同源性（图4）。由此推测， Dc4CL-1是胡萝卜4CL基因家族的新成员，其功能与其他成员具有相似性。

2.3 胡萝卜Dc4CL-1基因的表达分析

胡萝卜Dc4CL-1和4CL蛋白质都属于参与木质素合成的AFDⅠ亚族成员;与前人在水稻[5]、烟草[15]的研究结果相一致。已有研究表明，在胡萝卜生长、发育期间，野生胡萝卜根中木质素含量高于栽培品种[16-17]。本研究结果表明，在胡萝卜生长、发育期间，Dc4CL-1基因在野生品种中表达量较高，而在栽培品种中表达水平较低。尤其在种子发芽后60、90 d，其表达水平差异极显著（P<0.01）。野生品种在发育期间，Dc4CL-1基因相对表达水平变化没有明显的规律，但均较高（图5）。

3 讨论与结论

木质素是一种自然无组织的高分子聚合物，在维管植物中起着支撑其结构刚度和维持颜色的重要作用[18-19]。生产树木中木质素结构或含量的变化对于造纸工业和生物燃料的生产也具有重要性[6，20]。然而，肉质根作为胡萝卜可食用的器官，木质素含量过高会降低胡萝卜根的口感及质量[17，21]。外源赤霉素[17]、处理加工[22]及成熟化[21]都会影响胡萝卜根中木质素的含量。此外，胡萝卜木质素含量的降低对其繁殖、栽培也有一定的影响。有研究显示，香蕉（Masa nana）A基因组中有25个4CL基因同源序列，其中Mu4CL15在烟草中过表达能够增加烟草植株茎秆的木质素含量和抗倒伏能力，推测Mu4CL15极有可能提高香蕉植株假茎的抗倒伏能力。有研究表明，胡萝卜木质素大部分沉积在胡萝卜木质部导管的细胞壁上;在胡萝卜发育过程中[23]，木质素含量呈现连续下降的趋势，推测这可能与木质素生物合成相关基因的表达量降低有关[24]。本研究结果显示，Dc4CL-1基因在野生胡萝卜中高表达，而在栽培胡萝卜中低表达，推测Dc4CL-1基因与胡萝卜木质素的合成有关。

4CL基因是木质素合成的关键限速酶的调控基因，且4CL与植物腺苷酸构成酶的大亚组有关，由多拷贝基因编码;在其他蔬菜作物中已有相关报道，如白杨、水稻和烟草[5，15]。4CL氨基酸序列的系统重建显示，4CL蛋白分别划入Ⅰ、Ⅱ 2个亚组;其中，Ⅰ亚组4CLs与木质素及其他苯丙脂类的合成有更近的关系，而Ⅱ亚组4CLs与黄酮类有更近的关系[4-5，25]。有关于海南龙血树（Dracaena cambodiana）的研究表明，Dc4CL1属于ClassⅢ类4CL，血竭诱导剂能够诱导Dc4CL1基因的表达，为进一步阐明Dc4CL1基因在海南龙血树中类黄酮生物合成中的功能提供帮助[26]。在水稻的研究中发现，4CL基因家族有5位成员，其中Os4CL2属于TypeⅡ亚组，其他4位成员属于TypeⅠ亚组;研究还得出，Os4CL3表达量的降低显著影响木质素的合成且效果最好，降低植物体木质素含量，降低植株株高[27]。这些试验结果均表明，可以通过调节4CL基因的表达量来调控植物木质素的含量。

本研究通过BLAST比对和系统分析发现，野生胡萝卜中的新4CL属于Ⅰ亚组。无论野生胡萝卜，还是栽培胡萝卜，Dc4CL-1基因的表达水平与胡萝卜的总木质素含量呈正相关关系，由此推测 Dc4CL-1基因可能参与胡萝卜木质素的合成。但有报道说，根据胡萝卜基因组注释，4CLs均属于Ⅰ亚组。胡萝卜木质素的合成是一个复杂的过程，其不仅受多基因的影响，同时也受栽培环境、管理方式的影响，須要全方位深入研究。因此，须要发掘胡萝卜其他新4CL基因，乃至与木质素合成的相关基因都研究彼此之间的相关性及各基因的具体功能，并进行相关深入的研究，为植物木质素的相关研究提供更加有力的理论基础。

[14]Xu Z S，Tan H W，Wang F，et al. CarrotDB：a genomic and transcriptomic database for carrot[J]. Database，2014，2014：bau096.

[15]Souza C A，Barbazuk B，Ralph S G，et al. Genome-wide analysis of a land plant-specific acyl：coenzyme A synthetase（ACS）gene family in Arabidopsis，poplar，rice and Physcomitrella[J]. New Phytologist，2008，179（4）：987-1003.

[16]Tan G F，Wang F，Ma J，et al. Identification and analysis of the characteristics of a wild petaloid male-sterile carrot Wuye-BY[J]. Plant Genet Resour，2017，18（6）：1216-1220.

[17]Wang G L，Que F，Xu Z S，et al. Exogenous gibberellin enhances secondary xylem development and lignification in carrot taproot[J]. Protoplasma，2017，254（2）：839-848.

[18]Dixon R A，Chen F，Guo D，et al. The biosynthesis of monolignols：a“metabolic grid”，or independent pathways to guaiacyl and syringyl units？[J]. Phytochemistry，2001，57（7）：1069-1084.

[19]Koskinen O. Catalytic hydrogenation and hydrogenolysis of lignin model compounds in ionic liquid environment[D]. Helsinki：University of Helsinki，2017.

[20]陳 磊，陈汉平，陆 强，等. 木质素结构及热解特性[J]. 化工学报，2014，65（9）：3626-3633.

[21]Schafer J，Trierweiler B，Bunzel M. Maturation-related changes of carrot lignins[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2018，98（3）：1016-1023.

[22]Howard L R，Griffin L E. Lignin formation and surface discoloration of minimally processed carrot sticks[J]. Journal of Food Science，1993，58（5）：1065-1067.

[23]舒海燕，孙 威，魏 卿，等. 香蕉4-CL基因Mu4CL15的功能鉴定[J]. 基因组学与应用生物学，2017，36（8）：3025-3033.

[24]王广龙. 胡萝卜肉质根发育过程中激素和品质的变化规律研究[D]. 南京：南京农业大学，2016.

[25]Hu W J，Kawaoka A，Tsai C J，et al. Compartmentalized expression of two structurally and functionally distinct 4-coumarate：CoA ligase genes in aspen （Populus tremuloides）[J]. Proceedings of the National Academy of ences，1998，95（9）：5407-5412.

[26]夏栋楠，朱家红，李辉亮，等. 海南龙血树4-香豆酸辅酶A连接酶基因的克隆与表达分析[J]. 分子植物育种，2018，16（23）：7656-7662.

[27]Gui J S，Shen J H，Li L G. Functional characterization of evolutionarily divergent 4-coumarate：coenzyme a ligases in rice[J]. Plant Physiology，2011，157（2）：574-586.