基于网络药理学的清肺达原颗粒治疗新型冠状病毒肺炎多组分协同作用机制研究

居晨浩 吴夏秋 郭清

1.浙江中医药大学基础医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学健康管理研究所

新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）传染性强，潜伏期长，对全球人类的生命健康构成极大的威胁。截至4月30日，全球累计确诊病例3 190 743例，累计死亡病例227 368例[1]。按照目前的形势来看，全球新冠病毒感染状况依然得不到有效控制，并且新增确诊人数依然还处于上升的趋势，形势极其严峻。中医药千百年来一直守护着国人的健康，是疾病治疗方法的宝藏[2]。纵观古今，在同疫病抗争中，中医防治疫病的学术体系和临证方法也在不断完善。从2019年12月COVID-19疫情爆发以来，中医药第一时间介入治疗，以其独特的优势成为中国疫情防控的一大利器，起到了举足轻重的作用，到目前为止全国应用中西医结合疗法已治愈大量患者。

清肺达原颗粒（Qingfei Dayuan Granules，QFDYKL）原名“肺炎1号方”，是由达原饮合柴陷汤加减化裁而成，组方包括柴胡、黄芩、法半夏、党参、全瓜蒌、槟榔、草果、厚朴、知母、芍药、生甘草、陈皮、虎杖共13味中药。此方由国医大师梅国强与湖北省中医院巴元明等专家共同拟定而成，2020年2月23日经湖北省防控指挥部科技攻关组推荐，并由湖北省人民政府正式对外公布QFDYKL制剂成功获批并备案[3]。研究表明，使用QFDYKL等中西医结合治疗方案在改善COVID-19患者症状、影像学表现等方面有较好的效果[4]。根据目前国家卫生健康委员会和国家中医药管理局提出的观点，COVID-19属于“湿毒疫”范畴，“湿邪”是本病的关键病因[5-8]。中医认为，QFDYKL具有“化湿解毒、和解少阳”的功效，但其活性成分、药物靶点及其确切的分子机制尚不清楚。网络药理学是从机制层面上实现中医药现代化的新方法，能够为中医药的创新发展提供新的方法学依据[9]。基于此，本研究利用网络药理学的方法分析QFDYKL治疗COVID-19的有效成分、药物靶点和关键途径。

1 材料和方法

1.1 QFDYKL化学成分的搜集 通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）[10]检索QFDYKL的化学成分，并借助医学文摘资料库（Excerpt Medica Database，EMBASE）、Web of Science核心合集、 护理学数据库（Cumulative Index of Nursing and Allied Health Literature，CINAHL）等英文数据库和知网、万方等中文数据库收集TCMSP未收录的中药化学成分。

1.2 活性成分筛选与靶点的预测 以化合物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18作为活性化合物的筛选条件[11-12]，借助TCMSP数据库的药物成分筛选过滤功能，筛选出QFDYKL中具有良好OB和DL的化合物，即活性成分。确定活性成分之后，再利用TCMSP数据库中的靶点预测功能，收集QFDYKL中化学成分对应的靶点蛋白。对于TCMSP未收录的化学成分，选择Pubchem数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）获得其简化分子线性输入规范（simplified molecular input line entry system，SMILES），导入到结构相似度预测靶点数据库Swiss TargetPrediction （http：//www.swisstargetprediction.ch）和药效团模型预测靶点数据库Pharm Mapper （http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper）预测靶点。 最后利用Uniprot（https：//www.uniprot.org）数据库将通过以上方法得到的化学成分的相关靶点蛋白基因名称标准化。

1.3 基因本体（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 GO分析是注释基因和分析这些基因生物学过程的主要生物信息学工具。KEGG通路数据库是通过大型分子数据集生成的基因组测序和其他高通量实验技术的实用程序数据库资源来了解细胞、生物的高级功能和生物生态系统的数据库。本研究运用Cytoscape 3.7.0软件中的ClueGO+Cluepedia插件进行分析，以P＜0.05为统计指标。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络构建及网络拓扑分析 将QFDYKL的靶点导入String数据库，将研究物种选择为人类，设置条件score＞0.9为具有统计学意义，将具有PPI关系的结果以制表符分隔值（tab separated values，TSV）格式导出，再导入Cytoscape 3.7.0软件进行可视化，并采用网络拓扑分析工具加以分析。

1.5 “成分-靶点”网络分析和功能模块分析 运用Cytoscape 3.7.0软件及其插件构建 “成分-靶点”网络。运用Cytoscape 3.7.0软件对网络节点中心性进行分析，将度值（Degree）作为筛选条件，Degree越高，则与该成分相关的靶点越多，从而可以得出QFDYKL的核心成分。然后使用Cytoscape 3.7.0软件绘制PPI网络展示图，并使用分子复合物检测（molecular complex detection，MCODE）插件确定PPI网络中最重要的功能模块，最终得到子网络的核心基因（hub gene）。筛选条件设置：MCODE scores＞5，Degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100 and k-score=2。

2 结果

2.1 QFDYKL活性成分及其作用靶点信息的获取 通过TCMSP数据获得QFDYKL中活性成分242种，以OB≥30%且DL≥0.18为阈值筛选条件，得到活性成分共200种，其中柴胡17种、黄芩15种、党参21种、槟榔8种、草果8种、厚朴2种、知母15种、虎杖10种、陈皮5种、甘草92种、芍药5种、瓜蒌2种。部分中药具有相同的活性成分，其中MOL003896为党参和甘草共有化合物，MOL004492为知母和党参共有化合物，MOL000073为草果和槟榔共有化合物，MOL000354为柴胡和甘草共有化合物，MOL000098为柴胡、草果、全瓜蒌、虎杖、甘草共有化合物，MOL000422为柴胡、知母、芍药、甘草共有化合物，MOL000006为全瓜蒌、虎杖、党参共有化合物，MOL000211为芍药、甘草共有化合物，MOL004328、MOL000359为陈皮、甘草共有化合物，MOL000449为柴胡、知母、党参共有化合物。删去18种相同成分后，共获得182种活性成分。见表1。通过Pubchem数据库获得其SMILES，导入到Swiss TargetPrediction和Pharm Mapper数据库获得靶点。随后，通过Uniprot数据库对这些目标进行基因标准化，整合去重后共获得454个相关的作用靶点基因。

2.2 成分-靶点网络构建分析 该网络包括652个节点，198种活性成分，454个蛋白质靶点和6 588条边。见图1。网络结构中成分或靶点结合度值大于平均节点Degree（10.114）的有167个，其中排名前6的成分为芍药新苷（lactiflorin）、甘草酸（glycyrrhizic acid）、芍药二酮（palbinone）、异甘草素（isoliquiritigenin）、槲皮素（quercetin）和山奈酚（kaempferol）；排名前6的靶点为雌激素受体1（estrogen receptor 1，ESR1）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、前列腺素内过氧化物合 酶2 （prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、过氧化物酶体增生激活受体γ（peroxisome proliferative activated receptor γ，PPARG）、 糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3B）、周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinases 2，CDK2），表明这些成分和靶点在网络中发挥着重要作用。

表1-1 TCMSP中的182种有效活性成分及其参数Tab.1-1 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-2 TCMSP中的182种有效活性成分及其参数Tab.1-2 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-3 TCMSP中的182种有效活性成分及其参数Tab.1-3 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-4 TCMSP中的182种有效活性成分及其参数Tab.1-4 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

表1-5 TCMSP中的182种有效活性成分及其参数Tab.1-5 182 effectively active ingredients and their parameters in TCMSP

图1 “成分-靶点”网络Fig.1 “Composition-target” network

图2 药物靶点GO富集分析Fig.2 GO enrichment analysis of drug targets

2.3 相关药物靶点的GO富集分析和KEGG通路分析GO富集分析中分子功能 （molecular function，MF）主要涉及丝裂原活化蛋白激酶、活性氧反应等，细胞组成（cell composition，CC）主要涉及质膜的组成成分、内质网等，生物过程（biological process，BP）主要涉及内肽酶活性、单加氧酶活性等。见图2。KEGG通路分析提示共36条通路，药物靶点主要集中在丝裂原活化蛋白激酶 （mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR/ErbB）信号通路、肾素血管紧张素系统（renin angiotensin systems，RAS）信号通路、RAS相关蛋白1（RAS-related protein1，Rap1）信号通路、钙信号通路、cGMP依赖蛋白激酶G （cGMP dependentprotein kinase G，cGMP-PKG）信号通路。见图3。药物通过网络中的药物靶点，在酶活性的调控、血管生成和发育、细胞增殖调控和T细胞免疫调控等过程中发挥治疗COVID-19的作用。

图3 药物靶点的KEGG代谢通路分析Fig.3 Analysis of KEGG metabolic pathways of drug targets

2.4 PPI网络构建与分析结果 将药物靶点导入String数据库，将研究物种选择为人类，将minimum required interaction score设置为大于0.9，获得PPI网络。见图4。将PPI网络结果以TSV格式导出，再将所得数据导入Cytoscape软件进行PPI网络拓扑分析，Degree越高，在QFDYKL治疗过程中可能发挥的作用越重要，取Degree排名前20的靶点。见表2。主要靶点为磷酸肌醇-3-激酶催化亚基α肽（phosphoinositide-3-kinase subunit α，PIK3CA）、淀粉样β蛋白前体（amyloid β precursor protein，APP）MAPK1、MAPK3、90kDa热休克蛋白αA1（heat shock protein 90kDa αA1，HSP90AA1）、C-X-C趋化因子受体4型（C-X-C motif chemokine receptor type 4，CXCR4）等。

2.5 药物靶点的功能模块分析 使用Cytoscape绘制PPI网络，使用MCODE获得PPI网络中最重要的4个功能模块及其hub基因。见图5。筛选条件为MCODE scores＞5，Degree cut-off=2，node score cut-off=0.2，Max depth=100 and k-score=2。在PPI网络中得分较高的4个功能模块中，功能模块1得分21分，功能模块2得分13.429分，功能模块3得分10分，功能模块4得分8分。得分最高的功能模块1包含毒蕈碱型乙酰胆碱受体2（muscarinic acetylcholine receptor M2，CHRM2）、APP、前列腺素E受体3基因（prostaglandin E receptor 3，PTGER3）等基因，涉及认知、突触形成等方面。

3 讨论

QFDYKL由达原饮合柴陷汤加减化裁而成。小柴胡汤出自东汉·张仲景《伤寒论》，具有和解少阳的功效。血弱气尽腠理开，邪气陷入少阳表里之半，少阳经气不利，郁而化热，不可汗吐下，只能治以和解枢机、扶正祛邪之法。柴胡苦平为治少阳要药，透其邪热、疏泄气机；黄芩清热，柴胡配黄芩共奏升散外邪、清泄郁热、调和表里的效果[13]；生姜、半夏降逆化饮；人参、甘草、大枣和胃气，顾护脾胃，诸药相合，邪气得解，上焦得通，津液得下，胃气因和。《伤寒论翼·卷上·六经正义》：“邪入少阳表里之半，宜杂用表里寒热攻补之品，为防御解利之法。”[14]达原饮出自吴又可[15]《温疫论·温疫初起》，由槟榔、厚朴、草果、知母、芍药、黄芩、甘草7味药组成。槟榔善消磨，能除伏邪瘴气，为疏利气机之药；厚朴可破戾气之所结；草果辛温气烈，防伏邪蟠踞，可化太阴之湿；邪气盘踞募原，半表半里之地，外不得出表，内不能入里，极易化热，热伤津液，故加知母清热滋阴；芍药入血分，先安未受邪之地；黄芩清余热；甘草调和诸药。诸药合力，直捣巢穴，可使邪气溃败而速离募原，故名达原饮。小柴胡汤去生姜、大枣两味温补之药，而加瓜蒌清热化痰，陈皮理气燥湿，虎杖清热化湿、止咳化痰，合达原饮而成QFDYKL。纵观全方，集清郁热、祛疫邪、扶正气、化痰湿、和解少阳于一体，用于治疗COVID-19少阳兼痰湿热郁肺甚佳。

图4 蛋白互作网络Fig.4 PPI network

表2 Degree前20的靶点在PPI网络中的拓扑属性Tab.2 Topological properties of the top 20 targets in Degree in the PPI network

图5 PPI功能模块分析Fig.5 PPI functional modules analysis

本研究采用网络药理学的方法，揭示了QFDYKL可能的作用机制，发现QFDYKL治疗COVID-19是多靶点、多通路协同作用的结果。药物活性成分主要来源于柴胡、黄芩、知母、党参、甘草等中药。相同的化合物可以来源于不同种类的中药，同一化合物也可以对应多个靶点，同一靶点也可以对应不同化合物，这充分体现了中药多靶点、多成分的作用特点。QFDYKL中排名前6的活性成分，在治疗COVID-19过程中发挥抗菌、抗病毒、抗炎、止咳平喘、增强机体免疫力等作用。甘草酸（glycyrrhizic acid）可以与血管紧张素转化酶 2 （angiotensin converting enzyme 2，ACE2）结合，干扰新型冠状病毒与宿主的结合，抑制病毒侵入人体[16]。有研究表明，槲皮素（quercetin）可降低α平滑肌肌动蛋白、转化生长因子-β1等的表达，能够抑制大鼠肺泡细胞凋亡，并减轻其肺组织炎症以及纤维化损伤[17]。还有研究表明，山奈酚可以通过下调核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）增强信号通路的表达，减轻急性肺损伤小鼠的炎症和氧化应激损伤[18]。QFDYKL药物活性成分则主要通过作用于ESR1、AR、PTGS2、PPARG、GSK3B和CDK2等靶点治疗COVID-19。

KEGG通路分析发现，涉及MF的通路包括Ras信号通路、Rap1信号通路等，与化痰镇咳平喘相关的通路包括cGMP-PKG信号通路等，与炎症免疫相关的通路有花生四烯酸代谢 （arachidonic acid metabolism）等，与镇静相关的通路包括神经活性配体-受体相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction），与解热镇痛相关的通路有钙信号通路、cAMP信号通路等，提示QFDYKL通过调节炎症免疫、解热镇痛等相关通路，发挥治疗COVID-19的作用。PPI网络分析结果提示，QFDYKL治疗过程中发挥重要作用的核心靶点为PIK3CA、APP、MAPK1、MAPK3、HSP90AA1 和 CXCR4等，这些靶点与细胞生长分化、凋亡、炎症反应以及内分泌调节相关。进一步筛选后得到的4个得分最高的功能模块，其基因在治疗COVID-19的过程中相互作用。

中医药学以“整体观念”与“辨证论治”把握生命、疾病与药物的关系，包含着中华民族几千年的健康养生理念及其实践经验，是中华文明的瑰宝，凝聚着中华民族的博大智慧[19]。中药及其方剂具有多成分、多途径和多靶点协同作用等特点，在防治传染病方面具有其自身的特色和优势。在大数据的环境下，生物信息学、药理学等学科迅速发展，网络药理学也应运而生。网络药理学是研究药物的新模式，其整体性、系统性的特点与中医药整体观念、辨证论治的原则不谋而合，与中医药研究的有机结合是一个具有创新性的研究方向[4]。有关新型冠状病毒的相关研究正在不断增多，不可否认，本研究具有一定的局限性，有必要再通过相关实验研究对QFDYKL治疗COVID-19的作用机制进行验证。