WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌中的表达及其对预后的影响

刘 涛， 杨 燕， 刘红莉

1.西安交通大学，陕西 西安 727001； 2.铜川市人民医院检验科; 3.北京中医药大学孙思邈医院检验科； 4.西安交通大学附属广仁医院检验科

在世界范围内，肝癌是最常见的致死癌症之一。据报道，肝癌在全球最常见的癌症诊断中排名第六，也是2018年癌症相关死亡的第四大原因。相关数据显示，每年约有80万新发病例和78万死亡病例。而其中约80%的患者为肝细胞癌，乙肝病毒感染是肝细胞癌发生的主要危险因素[1]。尤其是在中国，约70%的肝细胞癌患者有乙型肝炎病毒感染史。虽然在过去的几十年中肝癌的治疗效果已大大提高，但5年总生存期仍然很低[2]。因此，识别更敏感的肝细胞癌的诊断和预后生物标志物势在必行。WNT1和WNT2均属于Wnt信号基因家族，有研究表明，WNT基因家族与各种肿瘤的生物学过程密切相关，包括细胞增殖、入侵、转移和耐药性等[3]。此外，有研究报道WNT表达异常与某些肿瘤的诊断和预后预测有关[4]。相关研究证实，WNT2可以激活Wnt/β-catenin信号传导通路，最终促进食管癌细胞生长，并通过诱导WNT2增强细胞活性和侵袭性[5]。为了探讨WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌中的表达及其对预后的影响，我院对80例乙肝相关肝癌患者进行研究，现将相关内容报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料选取2012年1月至2014年1月铜川市人民医院肝胆外科收治的80例乙肝相关肝癌患者作为研究对象，所有手术切除的癌组织和癌旁组织(距肿瘤边缘>2 cm)均储存于病理科。纳入标准：(1)乙肝相关肝癌患者均为初诊患者；(2)不合并其他严重疾病，包括心力衰竭、慢性肾功能衰竭等。排除标准：(1)合并有其他肿瘤的患者；(2)HIV感染患者；(3)资料不全、不配合随访的患者。本研究经医院伦理委员会讨论后通过，所有患者及其家属知情后签署知情同意书。

1.2 研究方法组织标本于24 h内取材，经甲醛固定后，进行石蜡包埋和切片。采用免疫组化EliVision二步法检测WNT1和WNT2蛋白表达，灭活内源性过氧化物酶、抗体孵育、DAB显色、苏木精复染、脱水、封片等。

免疫组织化学染色结果由专业病理医师采用双盲法读片判定，分别对WNT1和WNT2阳性细胞计数和阳性细胞染色强度评分。其中阳性细胞计数<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；根据阳性细胞染色强度分为阴性、阳性和强阳性，分别计0、1和2分。将上述两个评分相乘得到最终评分，若最终评分≥4分定义为高表达组，最终评分<4分定义为低表达组。

2 结果

2.1 WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌中的表达WTN1和WNT2在乙肝相关肝癌组织的高表达率(58.8%、71.3%)均显著高于癌旁组织(21.2%、22.5%)，差异均有统计学意义(P<0.05)(见表1、图1)。

表1 WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌患者中的表达[例数(%)]Tab 1 Expressions of WNT1 and WNT2 in hepatitis B related liver cancer patients [n(%)]

图1 WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌患者中的表达(SP法，放大100倍) A：WNT1在乙肝相关肝癌组织中阳性表达；B：WNT1 在癌旁组织中阴性表达；C：WNT2在乙肝相关肝癌组织中阳性表达；D：WNT2在癌旁组织中阴性表达Fig 1 Expressions of WNT1 and WNT2 in hepatitis B related liver cancer patients A: positive expression of WNT1 in hepatitis B related liver cancer tissues; B: negative expression of WNT1 in adjacent tissues; C: positive expression of WNT2 in hepatitis B related liver cancer tissues; D: negative expression of WNT2 in adjacent tissues

2.2 WNT1和WNT2表达水平与乙肝相关肝癌临床病理指标相关性分析乙肝相关肝癌患者WNT1表达水平与肿瘤大小、血管侵犯及HPV-DNA有相关性(P<0.05)，WNT2表达水平与肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期及HPV-DNA有相关性(P<0.05)(见表2)。

表2 WNT1和WNT2表达水平与乙肝相关肝癌临床病理指标相关性分析Tab 2 Correlation analysis of WNT1 and WNT2 expression levels and clinicopathological indexes of hepatitis B related liver cancer

2.3 WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌组织中的ROC曲线分析乙肝相关肝癌组织中的ROC曲线结果显示，WNT2具有潜在的预测价值(AUC=0.812，95%CI：0.768～0.857，P=0.000)(见图2)。

图2 WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌组织中的ROC曲线分析 A：WNT1在乙肝相关肝癌组织中的ROC曲线分析；B：WNT2 在乙肝相关肝癌组织中的ROC曲线分析Fig 2 ROC curve analysis of WNT1 and WNT2 in hepatitis B related liver cancer tissues A: ROC curve analysis of WNT1 in hepatitis B related liver cancer tissues; B: ROC curve analysis of WNT2 in hepatitis B related liver cancer tissues

2.4 不同WNT1和WNT2表达水平的乙肝相关肝癌患者5年生存率比较Kaplan-Meier生存率分析结果显示，WNT1和WNT2低表达患者5年生存率(72.7%、78.2%)显著高于WNT1和WNT2高表达患者(55.3%、49.1%)，差异有统计学意义(P<0.05)(见图3)。

图3 不同WNT1和WNT2表达水平的乙肝相关肝癌患者总体生存率比较 A：不同WNT1表达水平的乙肝相关肝癌 患者生存率比较；B：不同WNT2表达水平的乙肝相关肝癌患者生存率比较Fig 3 Comparison of overall survival rates in patients with hepatitis B related liver cancer with different WNT1 and WNT2 expression levels A: comparison of survival rates of patients with hepatitis B related liver cancer with different WNT1 expression levels; B: comparison of survival rates of patients with hepatitis B related liver cancer with different WNT2 expression levels

2.5 乙肝相关肝癌患者预后的影响因素分析Cox单因素分析结果显示，血管侵犯、TNM分期、HPV-DNA、WNT1表达及WNT2表达是乙肝相关肝癌患者预后的影响因素(P<0.05)(见表3)。Cox多因素分析结果显示，血管侵犯、TNM分期、WNT1表达及WNT2表达是乙肝相关肝癌患者预后的影响因素(P<0.05)(见表4)。

表3 乙肝相关肝癌患者预后的单因素分析Tab 3 Univariate analysis of prognosis in patients with hepatitis B related liver cancer

表4 乙肝相关肝癌患者预后的多因素分析Tab 4 Multivariate analysis of prognosis in patients withhepatitis B related liver cancer

3 讨论

既往研究证实，Wnt信号通路在毛发和皮肤再生，损伤后肝、肺的修复，造血，神经发生等众多生理病理过程中发挥重要作用[6]。此外，Wnt信号的异常调节可能导致多种疾病，包括癌症、骨质疏松症、自身免疫性疾病、神经系统疾病和内分泌功能紊乱。WNT基因家族是Wnt信号通路最重要的组成部分，参与各种癌症的发生和发展，如食管癌、胃癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌和白血病[7]。大量研究报道，WNT家族基因可能调节细胞增殖、分化、上皮-间质转化和Wnt信号传导[8]。最近的研究表明，Wnt信号通路中的关键调控因子WNT1诱导分泌蛋白-1通过多种信号通路，活化血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶2(MMP2)及MMP9等蛋白表达，参与调控肿瘤的增殖、侵袭和转移进程[9]。此外，有研究表明，Wnt信号传导通路中的信号转导因子WNT2基因与肿瘤的发生、侵袭转移及患者预后密切相关[4]。

本研究对80例乙肝相关肝癌患者的肿瘤组织和癌旁组织的WNT1和WNT2表达水平进行了分析，结果显示，WTN1和WNT2在乙肝相关肝癌组织的高表达率均显著高于癌旁组织。提示WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌的发生和发展过程中可能扮演重要角色。进一步分析结果显示，乙肝相关肝癌患者WNT1表达水平与肿瘤大小、血管侵犯及HPV-DNA相关，WNT2表达水平与肿瘤大小、血管侵犯、TNM分期及HPV-DNA相关。相关研究也证实，WNT2参与肿瘤细胞的增殖和迁移，而靶向干扰WNT2表达可以抑制肿瘤的生长、血管侵袭和转移，而WNT1的异常表达与淋巴结转移发生密切相关[10]。细胞实验结果显示，下调WNT1表达，可导致MMP9和VEGF-C蛋白表达降低，进而导致肿瘤细胞的侵袭、淋巴管新生能力降低[11]。为了进一步评估WNT1和WNT2的诊断价值，本研究构建了ROC曲线，分析表明WNT2可能作为乙肝相关肝癌的潜在诊断标志物。早期的发现也证实WNT家族基因可以作为某些癌症的诊断性生物标志物[12]。有研究选择RNA测序作为膀胱癌特异性RNA标志物的发现方法，发现WNT5A检测在膀胱镜检查中是一种有价值的补充策略，可以减少不必要的膀胱癌诊断程序[13]。此外，WNT6可作为骨肉瘤诊断的标志物[14]。

本研究Kaplan-Meier生存率分析结果显示，WNT1和WNT2低表达患者生存率显著高于WNT1和WNT2高表达患者。表明WNT1和WNT2高表达不利于患者的预后。本研究Cox单因素和多因素分析均显示，WNT1和WNT2显著影响乙肝相关肝癌患者的预后，推测WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌的发生和发展过程中可能存在协同作用。

综上所述，WNT1和WNT2在乙肝相关肝癌中的表达水平均显著升高，且与患者的预后密切相关，WNT2在乙肝相关肝癌中的诊断价值较高，值得进一步深入研究。