男性无精症或少精症患者细胞遗传学及Y染色体微缺失分析

马 科，周 燕，董 弘，白瑞芳，侯东霞，周雪原，王晓华，冀小平

(内蒙古自治区妇幼保健院，内蒙古 呼和浩特 010020)

近年来随着社会快速发展、生活压力及环境污染等多方面的影响，不孕不育患者的发病率呈上升趋势。据报道不育夫妇占已婚育龄夫妇10 %～15 %，因男性因素引起的不育约占50 %，其中遗传学因素所致不育占2 %～21 %[1]。染色体异常引起的男性不育类型有多种，临床症状与表现均不同，这些遗传学改变均会阻碍男性生殖腺或泌尿生殖道发育，对精子发育、形成产生影响，使精子在发育过程中停滞,造成无精症或少精症，从而使男性患者丧失生殖能力最终导致不育。Y染色体精子生成因子AZF(Azoospermia factor，AZF)位于Y染色体长臂，控制精子发生，分为三个相互独立区域：AZF a、AZF b、AZF c。相关研究已经证实，Y染色体AZF基因的主要作用是调节精母细胞增殖。当AZF基因出现微缺失时会导致无精症，不同基因亚区对精子生长有不同影响[2]。本研究对男性无精症或少精症患者进行细胞遗传学及Y染色体微缺失分析，探讨男性不育患者染色体核型异常及AZF(azoospermia factor，AZF)微缺失类型的分布，为男性不育症患者诊疗提供实验依据。

1 对象与方法

1.1对象 选取2012年1月至2019年5月在本院遗传科行遗传学检测的男性无精症或少精症患者228例，年龄22～38岁，平均年龄(28.3±1.2)岁，所有患者均参照世界卫生组织(WHO)标准进行精液常规分析，精液标本在3～7 d内射精获得，连续3次不同时间段进行精液检查，并经离心沉淀后镜检均无精子者为无精症，精子计数≤5×106/mL者为严重少精症[3]。

1.2方法

1.2.1外周血染色体核型分析 将肝素抗凝的外周血注入淋巴细胞培养基，37 ℃密闭式培养箱培养66～72 h。培养终止前加入0.01～0.02 mL浓度为20 ug/mL的秋水仙素，在37 ℃培养箱中继续培养4 h，低渗、固定处理制片。将制好的玻片经0.025 %的胰酶消化，然后用吉姆萨染液染色、镜检。每例计数20个细胞分裂中期的分裂相，分析5个核型。

1.2.2Y染色体微缺失检测 采用两管多重PCR扩增技术提取外周血淋巴细胞DNA，检测AZF微缺失，包括AZFa区SY84、SY86，AZFb区SY127、SY134和AZFc区SY254、SY255。

1.2.3统计学方法 使用SPSS 23.0软件对每种检测方法检出率进行统计学分析。采用χ2检验评价差异程度，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1外周血染色体核型分析结果 149例患者行外周血染色体核型分析，17例患者异常，染色体异常率为11.4 %。数目异常11例占异常总数64.7 %,其中9例47,XXY(Klinefelter综合征)、1例47,XYY、1例46,XY/45,X嵌合体；结构异常6例占异常总数35.3 %，其中2例常染色体结构异常、1例46,XY16qh+、1例46,XY t(X,12)(q21;q14)、2例大Y、1例小Y，详见表1。

表1 染色体核型分析检测结果

2.2Y染色体微缺失检测结果 188例Y染色体微缺失检测患者中检出9例异常者，检出率为4.78 %。异常类型AZFc区7例，AZFb区1例，AZFa+b+c区1例,详见表2。

表2 Y染色体微缺失检测结果

2.3两种方法联合应用检出率 109例患者既进行染色体核型分析又进行Y染色体微缺失检测，检出异常患者19例，异常检出率为17.4 %；单一进行染色体核型分析患者40例，检出异常患者4例，异常检出率为10.0 %；单一进行Y染色体微缺失检测79例，检出异常患者3例，异常检出率为3.8 %。两种方法联合应用较单一方法检出率高(χ2=8.522，P=0.014)。

表3 单一染色体核型分析、Y染色体微缺失检测及两种方法联合检测检出率

3 讨论

近年来新兴男性学科与遗传学关系较为密切，已引起医学界高度重视。男性无精症或少精症常见遗传缺陷包括染色体核型异常、基因拷贝数变异、单基因突变和多态性、Y染色体微缺失等。染色体畸变是导致男性不育的重要因素，据研究显示染色体异常发生率与精子生成为反比，性染色体异常和常染色体结构异常在不育男性中发生率高于正常男性[4]。性染色体数目或结构异常导致性器官发育不全，引起生精功能障碍，患者临床表现为先天性多发畸形，智力和生长发育迟缓，性腺和第二性征不发育等。AZF微缺失是引起男性生精障碍导致无精症或少精症的另一个常见遗传学因素。AZFc区缺失是最常见的Y染色体微缺失区域，包含较多与生精有关的基因，该区域基因缺失会对男性精子生成产生严重影响，随时间推移，精子数量可能会进行性减少。AZFb区缺失导致精子停滞在减数分裂前期或中期，使精子生成障碍，造成男性无精症或少精症。AZFa区缺失导致青春期精子形成过程受阻，临床表现为“唯支持细胞综合征”，无精子生成[5]。

根据近年来研究发现遗传因素对男性不育起着关键作用，其中以Klinefelter综合征为主的染色体核型异常及Y染色体长臂微缺失最为常见[6]。本研究Klinefelter综合征检出9例，占异常类型52.94 %，异常率高于其他异常类型，与上述研究结论一致。本研究检出Y染色体微缺失9例，其中AZFc区缺失7例，占总缺失类型77.8 %，是发生率最高的缺失类型；AZFb区缺失1例，占总缺失类型16.6 %；AZFa区未见缺失；AZFa+b+c区缺失型1例，对其行外周血染色体核型检测结果为45,X。临床症状表现为无精症、睾丸体积小、出现Ⅰ型唯支持细胞综合征。除上述常见的两种导致无精症或少精症的因素外，目前越来越多研究表明Y染色体的大小也会表现出相应遗传学效应。临床诊断大Y标准为Y≥18号染色体，小Y诊断标准为Y≤21号染色体。本研究发现2例大Y型，占异常的11.76 %；1例小Y型，占异常的5.88 %；

1例47，XYY核型，患者表现为身材较高大，性腺发育不全，精液检测为无精症。Y染色体数目异常导致精子形成时联会过程发生紊乱，引起患者无精。本研究中2例常染色体异常和1例次镒痕增加，均为常染色体结构异常。其中1例为罗氏易位，临床表现为少精，其智力正常。少精是由于罗氏易位干预减数分裂检验点，使细胞停滞于第一次减数分裂末而发生凋亡。无精可能与减数分裂过程中联会异常，不能形成配子有关[7]。另一例易位发生在常染色体与性染色体之间。研究表明，减数分裂过程中染色体易位可导致同源染色体之间无法正常配对，使精子发生过程受到影响，最终可能导致男性少精症[8]。

本研究无精症或少精症的男性患者染色体核型异常率为11.4 %(17/149)，与其他文献研究相近[9]。据国内外不同文献报道AZF缺失率为1.9 %～55.6 %，平均发生率为10.8 %[10]。本研究Y染色体微缺失异常率为4.78 %(9/188)，低于文献报道平均发生率。可能由于各研究选择对象来自于不同地区,因此缺失率存在地域差异。两种方法联合检测检出异常病例19例，异常检出率为17.4 %(19/109)。对比两种方法对无精症或少精症患者的检测，发现联合检测能够提高异常检出率。两种方法分别从细胞学水平和分子学水平对患者染色体进行检测，同时运用两种方法联合检测，能够从不同水平上筛查病因，提高患者病因的检出率。

无精症或少精症患者病因复杂，染色体核型异常及Y染色体微缺失是导致男性不育的遗传因素。对不育患者进行细胞遗传学及分子遗传学诊断，通过检测分型能够为不育患者找到病因，避免对患者进行盲目治疗，为其进行遗传咨询和制定合理的治疗方案提供更多帮助。