肝癌肿瘤干细胞标志物研究进展▲

彭忠异 阮 萍 张锡流

(1 广西中医药大学附属瑞康医院病理科，广西南宁市 530011；2 广西中医药大学第一附属医院病理科，广西南宁市 530023)

【提要】 肝细胞肝癌(HCC)的传统治疗方法对晚期肝癌、转移或复发患者的疗效较差，而肿瘤干细胞(CSCs)为肝癌的预后、诊断和靶向治疗提供了新的思路。识别CSCs及其相关的治疗靶点，对于提高HCC的治疗效果有重要意义。

肝癌是人类最常见的癌症之一。目前，肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的传统治疗方法有外科治疗、放疗、化疗、射频消融、肝动脉化疗栓塞术、肝移植和中医治疗等，但这些治疗方法对晚期肝癌、转移或复发患者的疗效较差。随着靶向治疗的兴起，肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)为肝癌的预后、诊断和治疗提供了新的思路。目前，人们普遍认为CSCs参与了肿瘤的发生、发展、转移和复发的过程[1]，因此，识别CSCs及其相关的治疗靶点对于提高HCC的治疗效果有重要意义。本文对近年来肝癌肿瘤干细胞的标志物以及这些标志物在肝癌中治疗意义的研究进展进行综述。

1 肿瘤干细胞表面标志物

自从在急性髓系白血病中发现CSCs的第一个证据以来[2]，许多肿瘤(包括肝癌)中CSCs的存在和CSCs表面标志物的鉴定已经通过免疫原性、致瘤性或功能特征的分析进行了研究[3]。以下一些细胞表面蛋白已被鉴定为肝脏CSCs标志物。

1.1 CD133 CD133是一种五跨膜单链糖蛋白，分别含有两个小的细胞内环和两个大的细胞外环，属于重要蛋白家族，是造血干细胞、神经干细胞和肝干/祖细胞的原始标记物[4]。CD133作为CSCs标志物在胃癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤组织中的作用已被证实[5]。CD133+肝癌细胞具有很强的增殖、分化和自我更新能力，成为研究肿瘤干细胞的重要靶向分子之一。CD133+肿瘤细胞在人类肿瘤细胞中仅占一小部分，但其临床意义重大。研究表明，与低CD133表达的患者相比，高CD133表达的患者总体存活率较低，复发率较高[5]。Lin等[6]发现熊果酸查尔酮以剂量和时间依赖性地抑制PLC/PRF/5和Huh7肝癌细胞CD133+的表达，使其自我更新能力降低，对阿霉素和长春新碱的敏感性增强，有望成为肝癌CSCs靶向分化的有效治疗剂。Li等[7]研究发现，异鸟嘌呤衍生物可抑制肝癌细胞生长，特别是在CD133+亚群中，可使肝癌细胞对索拉非尼的治疗更敏感。这些结果强调了靶向沉默CD133+肝CSCs以改善HCC治疗结果的重要性。综上所述，CD133作为肝癌重要的CSCs标志物之一，在肝癌等多种肿瘤中具有较强的增殖、自我更新能力，对CSCs靶向药物的治疗研究有一定的意义。

1.2 CD90 CD90(Thy-1)是卵圆细胞的表面标志，是一种分子量为25～37 kDa的糖基磷脂酰肌醇锚定糖蛋白，表达于T细胞、胸腺细胞、神经元、内皮细胞和成纤维细胞等多种细胞类型。近年来，CD90作为CSCs标志物在包括肝癌CSCs在内的多种肿瘤细胞中也受到关注。Yang等[8-9]发现CD90+肝癌细胞显示出致瘤和转移潜能，肝癌细胞系来源的CD90+细胞和肝癌患者组织/血液来源的CD45-CD90+细胞都会在免疫缺陷小鼠中产生肿瘤结节，从CD90+细胞衍生的异种移植在第二批和随后的第三批免疫缺陷小鼠中均可产生肿瘤结节，这些结果也提示血液中存在循环中的CSCs。Yang等[9]认为，显示出致瘤能力的是肝癌细胞株CD90+细胞而不是CD90-细胞。陈本栋等[10]也认为，CD90+细胞具有较强的侵袭能力，CD90+CSCs的潜在相互作用和离散特性对分子靶向治疗具有特异性的化疗敏感性和基因表达模式。近年来，越来越多的研究表明，CD90的下调可能是肝癌治疗的一个潜在靶点。Liu等[11]研究发现，CD90对HCC的特异性为91.9%，对预测低分化的敏感性为48.2%，这表明CD90对HCC的是一个有前途的靶点。

1.3 CD44 CD44是介导细胞和细胞外基质之间的黏附分子家族成员，作为一种细胞表面血凝素结合糖蛋白，其位于细胞表面，与细胞骨架蛋白相互作用。CD44对组织重塑、细胞基质黏附和细胞迁移具有重要作用，已被用作实体瘤干细胞的重要标志物。CD44现已广泛应用于多种实体瘤中CSCs与其他细胞表面标志物的联合鉴定。具有代表性的是，在人类乳腺癌中分离出CD44+CD24-CSCs/低细胞群体，这是在实体肿瘤中首次发现的[12]。在HCC方面，CD44为CD133+或CD90+CSCs群体提供了独特的细胞特征。Zhu等[13]研究表明，与CD133+CD44-肿瘤细胞相比，CD133+CD44+肿瘤细胞具有更多的干细胞特性，包括广泛的增殖、自我更新和产生分化后代的能力，并且能够以非常低的细胞数量在NOD/SCID小鼠体内启动肿瘤生长。CD44可能是更有效的治疗和加深对HCC进展和启动理解的特异性靶点。Williams等[14]强调CD44调节干细胞在肿瘤进展和细胞迁移过程中的行为，除信号转导和细胞-基质相互作用外，还包括分化和自我更新。用OSKM法(OCT4、SOX2、KLF4和c-MYC)建立了C3A来源的肝癌干细胞，命名为C3A诱导的CSCs；而肝癌干细胞中维持干细胞状态的高度恶性和低分化的肿瘤细胞归因于CD44。

1.4 上皮细胞黏附分子 上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)作为黏附分子家族中的单一跨膜糖蛋白，也被称为CD326，其由一个大的N-末端胞外区和一个短的C-末端片段通过单个跨膜区连接而成，已被认为是分离肝干细胞的最具代表性和最成功的标志物之一[15]。EpCAM最初被确定为HCC的早期生物标记物[16]。根据对一组HCC样本的转录组分析，EpCAM+肝癌显示出肝祖细胞特征明显的分子特征，包括存在已知的干/祖细胞标记，而EpCAM-肝癌表达的基因具有成熟肝细胞的特征[17]。此外，EpCAM+HCC表现出类似肝癌干细胞的特征，包括自我更新和分化，并且具有高侵袭性和致瘤性[18]，通过EpCAM+细胞亚集描述HCC的发展和侵袭性，为通过靶向β-catenin或Wnt信号成分(如EpCAM)根除HCC癌细胞开辟了一条新的途径。进一步的研究显示，与CD90+HCC相比，EpCAM+HCC与低分化、高血清甲胎蛋白水平和低远处器官转移发生率高度相关[19]。从机制上讲，EpCAM作为Wnt-β-catenin信号转导的靶基因[20]，可能通过促进Wnt-β-catenin信号拮抗剂对患者的药理反应来改善HCC的预后。同时，EpCAM还通过调节膜内蛋白水解介导C-末端片段释放来激活Wnt/β-catenin信号[21]。

1.5 CD13 CD13也被称为氨基肽酶N，是一种分子量150 kDa的膜表面糖蛋白，具有CSCs特性，在肿瘤的侵袭、血管生成和细胞增殖等过程中起重要作用，在肿瘤进展中发挥重要作用，如细胞增殖、癌灶内细胞簇的形成以及治疗过程中的生存能力[22]。最近在人肝癌细胞系和临床标本中发现CD13是一种新的细胞表面标志物，CD13+CSCs与临床肝癌标本中的缺氧标志有关。这提示CD13+CSCs在HCC的肿瘤增殖和抗肿瘤治疗中起主导作用[23]。Haraguchi等[24]采用Hoechst染料排斥法，发现CD13在人肝细胞癌中以半液态CSCs亚群的形式表达。CD13+细胞在NOD/SCID小鼠体内具有较高的致瘤潜能，并对化疗药物阿霉素和5-氟尿嘧啶表现出耐药性。CD13抑制剂乌苯美司可降低G0/G1期细胞比例，乌苯美司通过提高细胞内活性氧水平，促进细胞凋亡，提高5-氟尿嘧啶、顺铂和DXR的治疗效果[25]。Martin-Padura等[26]通过原位注射表达人甲胎蛋白和/或荧光素酶的肝癌细胞系和原代肝癌细胞，发现CD13+细胞处于微小残留病状态，这也表明靶向处于休眠状态的CSCs是治疗成功的关键。

1.6 CD24 CD24编码唾液酸糖蛋白并在成熟的粒细胞和B细胞中表达，同时调节这些细胞的生长和分化信号。CD24在人类各种癌症中也经常过度表达，并与不良预后相关。CD24是一种高度糖基化的小黏蛋白样细胞表面糖蛋白，在祖细胞或干细胞中表达。CD24+肝癌细胞对患者的临床预后有很大影响，在肿瘤的自我更新、分化、维持和转移中发挥重要作用[27]。Liu等[28]证实CD24作为肝癌干细胞的功能性标志物，利用STAT3介导的NANOG调控来推动肝癌干细胞的形成。 Twist2作为高度保守的螺旋-环-螺旋转录因子，对以CD24为基础的增强型肝癌干细胞的自我更新具有重要意义。Twist2-CD24-STAT3-NANOG通路可能在肝癌干细胞自我更新调控中起关键作用。近年来，靶向CD24已成为改善肝癌患者预后的一种新的靶向治疗方法。Zheng等[29]发现NDRG2(N-Myc下游调节基因2)通过调节CD24发挥抗癌活性。在肝癌细胞中，通过剂量和时间依赖的方式发现黄芩素可显著降低c-Myc的表达，而c-Myc是细胞生长、凋亡和细胞转化的关键调节因子。Han等[30]研究证实了黄芩素对肝癌细胞的有效抗肿瘤作用，提示黄芩素通过下调CD24来抑制细胞增殖和细胞存活。

2 肿瘤干细胞其他标志物

2.1 细胞质中的标记

2.1.1 OV6 肝卵圆细胞为位于肝脏门脉区域的肝干/祖细胞，具有双潜能，可分化为肝细胞和胆管细胞[31]。OV6是一种肝脏祖细胞/干细胞标记物，最近被确认为CSCs的推定标记物[32]。研究证实OV6+肝癌细胞在NOD/SCID小鼠体内具有较高的成瘤能力和对标准化疗的耐药性[33]。此外，激活Wnt通路可增加OV6+细胞水平，抑制β-catenin信号转导会导致OV6+细胞比例下降。CD133+在OV6+细胞中的表达明显富集，表明OV6+是一个潜在的CSCs标记物。Yang等[34]提出了利用磁珠分离方法从肝癌细胞系SMMC7721和Huh7中分离出OV6+细胞，发现这些OV6+肝癌细胞不仅在体外具有较强的自我更新能力和致瘤性，在NOD/SCID小鼠体内移植的OV6+肝癌细胞在体内外均表现出较强的侵袭力和转移潜能。此外，OV6+肿瘤细胞高表达与侵袭性临床病理特征及预后不良有关，在OV6+细胞中，CXCR4过表达，SDF1上调可导致OV6+HCC细胞数量增加，特异性CXCR4抑制剂(AMD3100)或针对CXCR4的siRNA转染可阻断SDF1的作用。提示OV6+肝癌细胞具有自我更新能力、致瘤性和侵袭性，肿瘤内OV6的表达受Wnt/β-catenin和SDF1/CXCR4信号通路的调控。由此提示，OV6+细胞在HCC的转移和进展中起重要作用。此外，CXCR4/SDF1轴提供了消除肝脏致瘤的治疗靶点。

2.1.2 乙醛脱氢酶 在人体的肾、肝细胞中，乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)作为一种解毒酶，可促进乙醛和乙醇代谢。ALDH是一种普遍存在的胞内酶，可催化多种细胞醛类的不可逆氧化。ALDH+细胞在乳腺癌、肝癌和急性髓系白血病等肿瘤组织中已被检测到，根据其增殖率、迁移和黏附能力而被认为是CSCs。ALDH+细胞的转移潜能高于ALDH-细胞，同时还促进了癌症的化疗耐药和氧化应激反应[35]。流式细胞仪测定高水平的ALDH可能是正常肝脏中的肝祖/干细胞和肝癌中CSCs的一个标志物[36]。Ma等[37]分析了几种不同的ALDH亚型在肝细胞系中的表达和ALDH酶活性，他们通过双色流式细胞术发现ALDH与CD133的表达呈正相关，且大多数ALDH+肝癌细胞表现出CD133+，但并不是所有的CD133+HCC细胞都是ALDH+，而CD133+ALDH+细胞明显比其他细胞更具致瘤性。这些数据表明，ALDH结合CD133可以更特异地标记致瘤CSCs。最近，Chiba等[38]通过激活ROS-p38MAPK通路，提示ALDH的小分子抑制剂可下调CSCs标志物的数量，抑制肝癌细胞的自我更新能力。此外，最近发现ALDH1A1的作用在HCC中得到了表现，其属于ALDH1家族的一个成员，由视黄烯合成视黄酸(retinoic acid，RA)，是RA信号通路的重要调节因子[39]。RA诱导基因转录，从而调节多种生物学过程，如细胞增殖、分化、细胞周期停滞和凋亡[40]。由于这些“茎性”的特征，ALDH1家族被认为是干细胞标记物[41]。

2.1.3 CK19 细胞角蛋白是一种典型的上皮细胞标记物， CK19是胆管细胞、肝祖细胞和早期肝母细胞的标志物，在正常人肝胆管细胞中表达，也散布于肝硬化和肝癌实质中[42]。CK19是HCC侵袭性强、预后差的标志物，与CK19阴性的HCC相比，CK19常与预后不良以及mRNA和上皮-间叶转换(epithelial mesenchymal transition，EMT)相关蛋白有关，CK19阳性的HCC显示出更频繁的主要血管侵犯[43]。CK19+在HCC中是一种干细胞性标志物，与侵袭力、肿瘤大小、肿瘤分化、转移和微血管浸润相关性强，是预测预后、患者生存和肿瘤复发的重要因素[43]。在CK19+肝癌细胞中，EMT相关蛋白表达增加，在肿瘤细胞侵袭过程中起主导作用[43]。研究还发现，超过90%的CK19+HCC细胞表达至少一个其他与干细胞相关的标记物，相比而言，EpCAM、c-kit和CD133单独表达的频率更高，这意味着CK19可能比其他标记物更“特异”地与干细胞相关。Kawai等[44]研究结果表明，CK19+细胞在体外具有较高的增殖能力和5-氟尿嘧啶抗性，提示CK19+细胞参与了Smad/TGFb信号和EMT的激活，这些特性可被TGFBR1抑制剂或CK19基因敲除所抑制。作为一个与Smad/TGFb信号和EMT相关的新的CSCs标记物，CK19被认为是抑制TGFBR1的良好治疗靶点。

2.2 细胞核中的标记

2.2.1 Nanog Nanog基因是DNA结合转录因子同源盒家族中的一员，最近在多能性促进基因的筛选中被发现。越来越多的证据表明，Nanog在肿瘤发生中起着至关重要的作用。功能丧失的相关研究表明，Nanog对上皮性恶性肿瘤的数量至关重要，部分原因是通过调节CSCs数量[45]。Nanog在实体瘤的发生发展中起着重要作用，其在乳腺癌、卵巢癌、结直肠癌、胃癌、头颈部鳞状细胞、肝细胞癌、肺癌及前列腺癌中的表达水平均上调[46-47]，提示Nanog可能在肿瘤发生中发挥潜在作用。肝癌细胞中的Nanog通过激活Nodal/Smad3信号通路促进EMT和细胞侵袭，高表达的Nanog会导致低表达的Huh7肝癌细胞的细胞侵袭力增加，并诱导具有Vimentin+/ Ecadherin-特征的EMT出现[48]。通过HepG2细胞系实验，Zhou等[49]发现HCV核心蛋白诱导Nanog表达后，磷酸化的STAT3蛋白表达增强，这种作用可通过抑制STAT3磷酸化而减弱。Yin等[50]研究提示Oct4和Nanog的共同表达与HCC的复发、转移、预后和耐药密切相关，随后的分子机制研究揭示了Oct4/Nanog调控的EMT通过STAT3依赖的Snail激活而改变。此外，STAT3的下调还抑制了Oct4/Nanog介导的EMT在HCC中的变化和侵袭/转移。这些发现为治疗具有CSCs样信号和EMT表型的HCC的进展和转移提供了一个新的治疗靶点。

2.2.2 SOX9 SOX9是SRY基因超家族的成员，是一些恶性肿瘤的原癌基因，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、卵巢癌、肠癌和胃癌[51-52]。通过上调Oct4，SOX9参与了癌症干细胞样特性的维持，包括自我更新、化疗耐药和致瘤性[53]。Guo等[54]首先分析了SOX9蛋白和mRNA在人肝癌组织中的表达，发现SOX9与患者的临床预后有关。SOX9在肿瘤分期越高、无瘤生存期越短、总生存期越短的肿瘤组织中表达越强。进一步研究表明SOX9指导的调节子miR101是潜在HCC的肿瘤抑制因子miRNA[55]，他们还发现靶标miR-101下调了SOX9的水平，这也得到了基因分析的证实，表明miRNA-101直接针对HCC组织中的SOX9。siRNA增强miR-101的表达和抑制SOX9的表达，不仅抑制了肝癌细胞的增殖，而且抑制了肝癌细胞的体外致瘤性。

3 肝癌肿瘤干细胞的靶向治疗

肝癌是一种高度恶性的肿瘤，在侵袭性、复发及转移上呈现较强的能力，发展到中晚期往往预后不良。传统治疗方法如外科手术、内科化疗、放疗及中医疗法对晚期、复发或转移的肝癌患者效果较差，这可能与肝脏CSCs的存在有关，去除肝癌CSCs则为治疗肝癌的新路径。目前基于肝癌肿瘤干细胞的靶向治疗显示出巨大潜力，靶向药物研究有一定的意义和成效，但大多仍然停留在科研及实验阶段。在实际靶点治疗肝癌中，仍不能彻底消灭癌细胞，未能阻止肝癌的发展、复发及转移。所以，在实际临床治疗方面还存在下述等待解决的问题：(1)肝癌CSCs的各种生物学特性有待不断阐明；(2)肝癌CSCs与正常干细胞存在许多相似性，如何提高靶向治疗的特异性，是需要解决的问题。

4 小结与展望

肝癌CSCs标志物除上述[CD133、CD90、CD44、EpCAM(CD326)、CD13、CD24、OV6、ALDH1、CK19、Nanog、SOX9]标志物外，仍有Nestin、CD47、GST-P等多个肝癌CSCs标志物被报道。肝癌CSCs标志物是研究肝癌CSCs的切入点，肝癌CSCs标志物的研究可为肝癌的靶向治疗开辟新的道路。虽然目前尚停留在初级阶段，随着研究的深入以及各项瓶颈的突破，比如肝癌CSCs生物学特性的不断阐明，可研发出针对肝癌CSCs特异性靶点的药物，在消除肝癌CSCs的同时，对正常细胞无不良影响, 使明显提高肝癌的治疗效果成为可能。