miRNA-342表达与膀胱癌患者预后的关系分析

郭宗华，孔东波，邹伟

咸宁市中心医院湖北科技学院附属第一医院泌尿外科，湖北 咸宁 437100

膀胱癌是全球第二大常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤，是泌尿生殖系统肿瘤患者的常见死亡原因，在2015年导致约18万人死亡[1]。研究表明，尽管膀胱癌的5年生存率为77%，但根据膀胱癌的类型和分期而有所不同。当肿瘤为浸润性但未扩散到膀胱外时，其5年生存率仍为70%，但如果肿瘤细胞迁移到周围组织（如前哨淋巴结和器官）并扩散到远处器官，则5年生存率分别下降至35%和＜10%。所以，早期发现没有近处和远处转移的膀胱癌对于提高膀胱癌患者的生存率至关重要[2]。因此，迫切需要鉴定生物标志物以为膀胱癌的早期发现、病情监测提供更多依据。微小RNA（miRNA）是一类内源性表达的约22个核苷酸长的小非编码RNA，在转录后水平负调节基因表达。miRNA参与广泛的生理过程，包括细胞周期、增殖、转移、凋亡[3]。最近，越来越多的证据表明，miRNA可以根据其靶miRNA的功能发挥抑癌或致癌的作用[4]。更重要的是，miRNA的异常表达可以作为诊断和预后的生物标志物。在10例年龄、性别和吸烟状况相匹配的非肌肉浸润性膀胱癌病例和相应健康对照人群中对血清miRNA进行的高通量筛选中发现，miRNA-342的高表达与膀胱癌发生风险显著降低有关。在随后的大样本研究中，miRNA-342高表达的膀胱癌患者年龄普遍偏低、恶性程度偏高[5]，而在肝癌、多发性骨髓瘤、非小细胞肺癌中miRNA-342则发挥抑癌作用[6]。这些结果表明，miRNA-342可能在膀胱癌中起作用但其具体意义还需进一步探究。本研究中，检测了膀胱癌组织和正常膀胱组织之间的miRNA-342表达差异，并评估了miRNA-342表达在膀胱癌患者中的临床意义及与预后的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2010年11月至2014年12月咸宁市中心医院泌尿外科收治的行根治性全膀胱切除术或膀胱部分切除术的原发性膀胱癌患者的病历资料。纳入标准：经病理学确诊为原发性膀胱癌；术前未行放化疗，且无其他部位原发性肿瘤。排除标准：不愿或难以配合随访；严重营养不良及合并心、肝、肾等主要脏器严重疾病；患精神疾病。根据纳入、排除标准，共纳入200例原发性膀胱癌患者，男121例，女79例；年龄54～76岁，平均（63.0±4.9）岁；T1～2期141例，T3～4期59例；单发肿瘤101例，多发肿瘤99例。收集200例患者术后膀胱癌组织和邻近的正常膀胱组织。将手术切除的所有标本冷冻并保存在液氮中直至后续实验。

1.2 试剂及实验仪器

TRIzol®试剂、实时聚合酶链反应（realtime polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒和逆转录试剂均购自日本Takara公司；miRNA-342及内参U6引物设计和合成均由上海吉玛科技生物有限公司完成。酶标仪、分光光度计和PCR仪均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 临床资料收集及随访 由两名病理学医师独立检查苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色的组织切片，以确定每个标本的肿瘤分期和组织学分级。所有患者均收集性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤数量等临床资料，其中复发定义为膀胱腔内出现任何新的肿瘤。所有患者获取完整随访资料，包括地址及联系方式，以门诊复查、电话方式对入组患者进行随访，随访至2019年12月，观察终点为总生存期（overall survival，OS）：确诊膀胱癌至最后因癌症死亡的时间。

1.3.2 RNA提取及RT-PCR检测 使用TRIzol®试剂分离组织总RNA，按照说明书进行操作。使用高容量cDNA反转录试剂盒将2 μg总RNA逆转录为cDNA。RT-PCR反应是在Bio-Rad CFX96序列检测系统上使用Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG试剂进行，以U6作为内部对照，引物序列：miRNA-342正义，5'-AAGATGTGGAAAAATTGGAATC-3'，miRNA-342 反 义 ，5'-ATTCTAATTTCTCCACGTCTTT-3'；U6正 义 ，5'-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3'，U6反义，5'-GGGTGTCGCTGTTGAAGT-3'。反应条件为95℃30 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s）×40个循环，使用2-△△Ct表示miRNA-342相对表达量，依据miRNA-342相对表达量中位数5.421将患者分为miRNA-342高表达组（n=98）和miRNA-342低表达组（n=102）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，计数资料以例数及率（%）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，Logrank检验比较生存情况；影响因素的单因素及多因素分析采用Cox回归分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织及正常膀胱组织中miRNA-342相对表达量的比较

膀胱癌组织中miRNA-342相对表达量为（3.42±0.61），明显低于正常膀胱组织中的（7.31±1.21），差异有统计学意义（t=28.71，P=0.000）。

2.2 不同临床特征膀胱癌患者的膀胱癌组织中miRNA-342表达情况的比较

不同肿瘤分期及是否淋巴结转移和复发的膀胱癌患者的膀胱癌组织中miRNA-342表达情况比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；不同性别、年龄、肿瘤大小和肿瘤数量膀胱癌患者的膀胱癌组织中miRNA-342表达情况比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表1）

2.3miRNA-342高表达与低表达膀胱癌患者生存情况的比较

miRNA-342高表达患者中位总生存时间为51.2个月，1年、3年、5年生存率分别为93.8%、79.5%、35.7%，miRNA-342低表达患者中位生存时间为36.1个月，1年、3年、5年生存率分别为78.4%、51.9%、17.6%，miRNA-342高表达患者的生存情况明显优于miRNA-342低表达患者，差异有统计学意义（χ2=4.549，P=0.003）。（图1）

2.4 膀胱癌患者预后影响因素的单因素及多因素分析

以Cox比例风险模型进行单因素和多因素分析。单因素分析表明，肿瘤分期、淋巴结转移、复发和miRNA-342表达与膀胱癌患者预后有关（P＜0.05）（表2）。多因素分析表明，肿瘤分期、淋巴结转移、复发、miRNA-342表达均是膀胱癌患者预后的独立影响因素（表3）。

表1 不同临床特征膀胱癌患者的膀胱癌组织中miRNA-342表达情况的比较（n=200）

图1 miRNA-342高表达（n=98）与低表达（n=102）膀胱癌患者的生存曲线

表2 膀胱癌患者预后影响因素的单因素分析

表3 膀胱癌患者预后影响因素的多因素分析

3 讨论

作为泌尿系统的常见恶性肿瘤之一，约40%的膀胱癌患者会经历多次复发，严重影响了患者的生活质量。由于目前没有可靠的诊断性生物标志物可用于早期膀胱癌的检测，造成了早期发现膀胱癌非常困难。复发与膀胱癌的分期有关，因此迫切需要具有高灵敏度和特异度的新型生物标志物作为膀胱癌的诊断和预后工具[7]。

异常的miRNA表达是癌症发展过程中的一个常见且重要的特征。越来越多的研究表明，miRNA调节包括膀胱癌在内的各种类型恶性肿瘤中许多与侵袭和转移相关的基因表达[8]。例如，miRNA-29c可通过调节细胞周期蛋白依赖性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6）抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miRNA-124-3p过表达显著抑制了膀胱癌细胞的迁移和侵袭能力[9]。另一项研究表明，miRNA-155通过抑制肿瘤抑制物周期素D相互作用蛋白1充当膀胱癌的肿瘤启动子[10]。这些结果表明，miRNA在膀胱癌的进展中起关键作用。目前也有研究证明了miRNA作为膀胱癌预后生物标志物的潜在作用。例如，膀胱癌标本中miRNA-148a表达降低，而miRNA-148a表达降低与较短的生存时间有关[11]，miRNA-34a的下调与膀胱癌复发风险降低有关[12]。

在实体肿瘤中，miRNA-342被鉴定为肿瘤抑制因子。例如，miRNA-342通过抑制肺癌中的叉头蛋白 M1（forkhead box protein M1，FOXM1）抑制肺癌细胞增殖[13]，miRNA-342靶向前梯度蛋白2（anterior gradient 2，AGR2）抑制子宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭[14]。Ma等[15]报道miRNA-342通过直接抑制人肺癌中的转录因子E2F调节MYC转录活性。在肝癌中，miRNA-342通过调节核因子κB途径影响细胞增殖[16]。在膀胱癌患者血清miRNA高通量筛选中发现，miRNA-342被认为对膀胱癌的发生起到抑制作用，但miRNA-342高表达的膀胱癌患者发生年龄普遍偏低[5]，这一结果说明miRNA-342参与了膀胱癌的发生发展，但miRNA-342是否会影响膀胱癌患者的预后仍不明确。本研究首先检测了膀胱癌组织和相应正常膀胱组织中miRNA-342的表达，并显示miRNA-342在膀胱癌组织中表达降低。然后，本研究观察到miRNA-342表达降低与临床晚期、复发和有关，这表明miRNA-342表达降低可能促进膀胱癌的侵袭性表型。此外，本研究评估了miRNA-342在膀胱癌预后监测中的作用，发现miRNA-342表达水平较低的患者总生存时间比miRNA-342表达水平较高的患者短，Cox比例风险回归模型的单因素和多因素分析进一步支持了这些发现，表明miRNA-342是膀胱癌的独立预后因素。

综上所述，miRNA-342表达在膀胱癌组织中明显降低，膀胱癌组织中较低水平的miRNA-342与患者总生存时间缩短有关。miRNA-342是膀胱癌的独立预后因素，可作为膀胱癌的预后生物标志物。