基于荧光碳点建立乳制品中四环素的快速检测方法

文/何智燕 王蓓蓓

（扬州大学旅游烹饪学院）

乳制品安全是关乎健康的重大民生问题。四环素类抗生素是养殖业中常用的兽药和饲料添加剂，具有抑菌范围广、杀菌能力强、成本低廉等优点，作为牛奶中常用的添加抗生素，其残留问题受到人们的日益关注。长期食用含有四环素类抗生素的乳制品容易造成肝和肾脏的损伤，引发过敏和中毒反应，还会使牙齿变黄，严重影响人类的身体健康[1，2]。检测四环素有很多种方法，但是大多数都比较繁琐，其中ELISA可以对样品进行直接检测，但需要多次洗涤、加液、显色等操作步骤；而胶体金免疫层析法检测灵敏度只能达到50～100 μg/L[3]。

碳点是一种新型的碳基零维材料，具有优秀的光学性质、良好的水溶性、低毒性、环境友好、原料来源广、成本低、生物相容性好等诸多优点。碳点大多具有sp2杂化碳的骨架结构，其表面带有大量碳的含氧基团[4～7]（如羟基、羧基等），表现出优良的荧光性能，如耐光漂、非闪烁、发射波长可调、上转换性能等。因此，可以和其他碳纳米材料（碳纳米管、石墨烯、富勒烯、纳米金刚石等）在材料科学、生物化学、电子器件以及生物医学等方面发挥同等重要的作用[8～10]。

在前人研究的基础上，本文以L-型半胱氨酸、五氧化二磷和水反应合成荧光碳点（CDs），经离心获得碳点溶液，以其作为荧光探针进行一定浓度的稀释，在pH值为7.4的磷酸缓冲盐溶液（PBS）缓冲溶液中，以检测对象四环素对其有猝灭现象为机理，建立一种快捷、灵敏检测微量四环素含量的荧光分析法。该试验对四环素含量的测定方法，已初步应用在实际牛奶样品的检测中，且该方法具有操作简单、选择性高、试验成本低、灵敏应用范围广等特点。

1 材料与设备

1.1 主要材料与试剂

磷酸盐缓冲溶液（PBS）；三羟甲基氨基甲烷缓冲溶液（Tris-HCl）；四环素标准溶液。

1.2 仪器与设备

台式离心机：科大创新股份有限公司；荧光分光光度计：上海棱光技术有限公司；紫外-可见分光光度计：上海元析仪器有限公司。

2 试验方法

2.1 碳点的制备

分别称取0.04 g L-半胱氨酸和2.50 g五氧化二磷置于洁净的烧杯中，混合均匀，量取2.0 mL纯水一次性加入该烧杯中，产生剧烈反应，爆出大量白烟后得到棕黄色、略有黑点的透明溶液，将其转移置于离心机中离心（5 000 r/min，5 min），取上清液，放置一段时间，多次重复上述离心的上清液所得的碳点置于4 ℃冰箱中保存，用于进一步的鉴定和使用。

2.2 碳点的表征

在常温条件下，取碳点原液置于比色皿中，在紫外-可见分光光度计中测定其紫外吸收光谱和荧光发射光谱。在测碳点溶液荧光光谱时，激发和发射狭缝宽度均为10 nm，扫描电压为900 V，扫描速度为1 000 nm/min，激发波长为380 nm。在上述条件下，改变激发波长（310～390 nm），测定不同激发波长下对应碳点的荧光光谱。

2.3 四环素猝灭荧光碳点的反应机理探讨

2.3.1四环素对荧光碳点的初步测量

在pH值为7.4的PBS中，加入一定量的碳点溶液和1.0×10-4mol/L的四环素溶液，以不添加四环素的碳点溶液为空白对照，于荧光分光计中检测，观察添加四环素碳点溶液的荧光变化。

取等量的碳点溶液，分别加入不同浓度的四环素溶液，置于紫外灯下观察不同浓度的四环素对碳点荧光的猝灭情况。

2.3.2不同浓度的四环素对碳点的荧光猝灭情况检测

在pH值7.4的PBS中，加入一定浓度的碳点溶液，再加入不同浓度的四环素溶液，经反应一定时间后，检测碳点的荧光猝灭情况。以不加四环素的碳点溶液为对照组。

2.4检测条件的优化

2.4.1体系中pH值的优化

为确定体系的最佳反应pH值，在最佳的碳点使用浓度和反应时间下进行pH值的优化，即在pH值6.6、7.0、7.2、7.4、8.0下，分别检测体系荧光变化量。

2.4.2反应时间的优化

为确定该体系的最佳反应时间，在最佳的碳点使用浓度和pH值下，配制5组体系，前4组每隔5min检测1组体系，后1组每隔15min检测1次，最终测得5组的荧光改变量。

2.4.3反应温度的优化

为确定体系的最佳反应温度，在最佳的碳点使用浓度、pH值和反应时间下，配制 5 组体系，每组体系的温度分别设为0 ℃、5 ℃、15 ℃、25 ℃、50 ℃，分别检测各组荧光改变量。

3 结果与分析

3.1 碳点的光谱表征

如图1可见，该碳量子点在紫外光区300～500 nm有很强的吸收，在此波段内随波长的增加而吸收强度逐渐减弱。

图2可观察到该方法制得的碳点具有很高的荧光性，且最高荧光强度已经超越了仪器的量程，因此可以适当稀释碳点浓度，以方便试验的进行。

图3为不同激发波长下碳点的荧光发射峰。由图可见，碳点在不同的激发波长下均有荧光发射峰。随着激发波长的增大，荧光强度先增大后减小，荧光峰位置不变，说明该方法合成的荧光碳点的荧光峰的位置不受激发波长影响。以380 nm为激发所得出的荧光峰值最高，确定后续试验选择380 nm为碳点的最佳激发波长。

3.2 四环素对碳点的荧光猝灭作用

图4为380 nm激发波长下，碳点溶液（a）以及添加四环素的碳点溶液（b）的荧光发射光谱图。从图中很明显看出，加入四环素的碳点溶液荧光峰有很明显的下降，说明四环素对碳点有明显的猝灭作用。

图1 碳点的紫外吸收光谱

图2 碳点的荧光发射光谱

3.3 四环素猝灭碳点荧光的反应机理的探讨

本试验探讨了四环素浓度对碳点猝灭的规律性。图5为在pH值为7.4的PBS中，加入一定量的碳点溶液，再分别加入不同浓度的四环素，以得到碳点的荧光发射光谱变化图。

图3 不同激发波长下碳点的荧光值变化趋势

图4 380 nm激发波长下，碳点溶液（a）以及添加四环素的碳点溶液（b）的荧光发射光谱图。

从图5可知，随着四环素的浓度不断增加，碳点的荧光强度逐渐下降，但是其荧光峰值的波长仍然在435 nm左右。结果说明，加入四环素后体系发生变化，导致碳点的荧光猝灭。分析原因可能是由于四环素可以和荧光碳点表面的羟基和羧基发生络合反应[11]，从而产生非特异性相互作用，对碳点的荧光产生猝灭所致[12]。而且这种下降的梯度具有规律性，线性关系趋势很明显，由此可以构建一种以荧光碳点的猝灭机理来检测四环素含量的方法。

3.4 检测条件的优化

3.4.1 体系中pH值的优化

针对四环素对碳点猝灭的反应pH值进行优化，发现反应pH值在7.4时，四环素对碳点的猝灭已经达到最大，再继续反应，效果稍有不佳，猝灭也趋于稳定，故本试验将反应pH值确定为7.4（图6）。

3.4.2 反应时间对体系荧光改变量∆F的影响

针对四环素对碳点猝灭的反应时间进行优化，结果发现反应时间在5 min时，四环素对碳点的猝灭已经达到最大，再继续反应，效果稍有不佳，猝灭也趋于稳定，故在本试验后的反应时间确定为5 min（图7）。

3.4.3 反应温度对体系荧光改变量∆F的影响

针对四环素对碳点猝灭的反应温度进行优化，结果发现反应温度在25℃时，四环素对碳点的猝灭已经达到最大，其它温度下也有改变，但均小于此温度下的荧光变化量，故在本试验的反应温度确定为25℃（图8）。

3.5标准曲线和检出限

在上述各种优化条件下进行检测，考察碳点在检测四环素的线性范围以及最低检出限，并根据试验结果绘制了标准曲线，结果如图9所示。试验结果表明，当四环素浓度在1.0×10-2～1.0×10-7mol/L范围增加时，检测体系的整体荧光强度随之呈规律性的下降趋势。以四环素浓度以10为底的对数值为 X，以碳点的荧光变化量ΔF为Y，建立线性回归方程Y=106.09X+835.51，线性相关系数为0.9728。以不添加四环素的碳点体系溶液作为空白溶液，平行测定10 次，以3倍信号强度的标准偏差除以转换后的标准曲线斜率，最终得到的检出限为4.3×10-7mol/L。

图5 不同浓度的四环素对碳点的荧光猝灭作用

图6 pH值对体系荧光猝灭的影响

图7反应时间对碳点的荧光猝灭的影响

3.6 实际样品中四环素含量的测量

本试验以伊利纯牛奶样品作为研究测定对象，经过脱脂、稀释等前处理后得到10-1和10-22个稀释度，在稀释的体系中加标样品检测其荧光猝灭，带入标准曲线计算出标准方差、回收率。结果得出表1，其标准差分别为0.0125和0.035，回收率为123%和120%，回收率较高原因可能是所检测样品中本来就含有微量的四环素。

4 讨论

乳制品中四环素类药品残留的快速检测方法有很多种，本试验建立的荧光分析方法具有较高的灵敏度和选择性，且合成碳点的方法简单、方便、快捷，荧光性良好且稳定。在进行正式试验前，通过大量预试验的比较分析，得出时间、pH值、温度这3 个因素对荧光猝灭的影响比较大。因此，本试验选定这3 个因素，分别进行优化试验，然后在优化条件下得出良好的线性方程Y=106.09X+835.51，较高的相关系数 0.9728，较宽的检测线性范围级检出限4.3×10-7mol/L，测定不同浓度的四环素对碳点荧光猝灭的影响。本试验检测牛奶样品测得的回收率超过100%，可能是所测样品本身含有微量的四环素存在。本方法实现其定性检测的高效性和定量检测的准确性，寄希望在深入开展乳制品中四环素类兽药残留检测技术中提供一条新的技术路线

表1 实际样品的检测

图8 反应温度对碳点的荧光猝灭的影响

图9 荧光强度变化量与四环素浓度之间的线性关系