hERβ重组质粒pEGFP-C1-hERβ对PC-3M细胞凋亡的影响

于铠铭

【摘    要】前列腺癌（PCa）是男性常见的恶性肿瘤，在美国男性癌症病死率为第2位，仅次于肺癌。近十年来PCa发病率在许多国家中（包括中国在内的）有逐年上升的趋势。目前我国PCa的发病率在男性泌尿系统肿瘤的位居第3位。目前普遍认为雌激素与雌激素受体（ER），特别是ERβ在PCa的发生、发展、恶变和转移过程中发挥重要作用。研究发现：雌激素与抗雌激素对前列腺癌PC-3细胞株均有抑制作用;抗雌激素对前列腺癌DU145细胞株有抑制作用。本实验通过重塑ERβ在前列腺癌PC-3M细胞株中的表达，研究和分析ERβ对前列腺癌细胞凋亡信号传导途径的影响。

【关键词】前列腺癌  雌激素  抗雌激素

中图分类号：G4      文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1672-0407.2020.15.200

一、材料和方法

（一）材料

人前列腺癌细胞株PC-3M（ATCC）。真核表达载体pcDNA3.1、脂质体Lipofetion2000（Invitrogen），pEGFP-C1质粒、限制性内切酶BamH I、HindⅢ、TA克隆载体（pMD18-T Vector）、T4 DNA连接酶及质粒提取和纯化试剂盒（TaKaRa），Trizol（GIBCO），胎牛血清（Hyclone），高保真Taq DNA聚合酶（Sangon）等。ERβ兔抗人多克隆抗体、β-actin羊抗人多克隆抗体、碱性磷酸酶标记与辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体（SANTA CRUZ）;Caspase-3、Caspase-9兔抗人多克隆抗体（北京中山金桥生物技术有限公司）。本实验所用引物均为上海生工公司合成。

（二）方法

1. pEGFP-C1-hERβ重组质粒的构建及鉴定。在前期工作中，应用基因重组技术，构建pEGFP-C1-hERβ重组质粒;采用质粒提取试剂盒，按产品说明提取质粒，应用HindⅢ和Xhol进行双酶切鉴定及双向自动测序分析仪测序分析鉴定构建的质粒。

2.细胞培养与转染。人激素非依赖性前列腺癌细胞株PC-3M细胞（1×106）接种于100 mL培养瓶中，于IMDM培养基（含10%小牛血清）， 37℃，5% CO2条件下常规培养。当贴壁细胞达到70%-80%融合时，取重组质粒6μg，以脂质体法转染细胞，培养24 h。同时设阴性对照组（只加脂质体，不加质粒）和空质粒对照组（转染pEGFP-C1）。然后换完全培养基（含10%小牛血清）继续培养48 h，荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白（GFP）的表达，收集细胞备用。

3. 免疫细胞化学染色分析。转染细胞48 h后离心，收集细胞（同上），调整细胞浓度为1×106，取10μL滴加到用多聚赖氨酸处理过的玻片上，室温放置30 min;以4%多聚甲醛固定，Triton-X 100 洗10 min;3% H2O2 孵育25 min（以阻断内源性过氧化物酶）;室温反应1 h;滴加生物素化羊抗兔IgG于盖玻片上， 37℃ 孵育30 min;滴加辣根过氧化物酶（HRP）标记的亲和素，37℃ 孵育30 min;上述每步抗体均为50μL/片，反应后均用PBS洗涤3次。最后于光学显微镜下观察并照相。结果判定：细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。

4.流式细胞仪检测细胞凋亡峰。将生长状态良好的PC-3M细胞分为两组，实验组转染pEGFP-C1-hERβ（2μg/mL），对照组转染pEGFP-C1，培养72 h，分别制成单细胞悬液。用流式细胞仪做单参数分析，每份样品检测1×104细胞。

5.吖啶橙染色凋亡细胞。将转染pEGFP-C1-hERβ和pEGFP-C1质粒的PC-3M细胞经胰酶消化，离心，洗涤，弃上清，细胞计数，调整细胞浓度为1×106/mL。取95μL加入0.1%的吖啶橙（AO），熒光显微镜观察细胞颜色及形态。

6.TUNEL染色分析。取10μL胰酶消化处理后的PC-3M细胞（浓度为1×106/mL），滴加到预先用多聚赖氨酸处理的玻片上，室温放置30 min。4%多聚甲醛固定30 min。用新鲜配制的3%H2O2，室温处理10 min。在标本片上加TBS（0.01M） 1∶200新鲜稀释的Proteinase K，在37℃消化1-15 min。加标记缓冲液20μL/片（以保持切片湿润）。每张切片取末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）和地高辛标记的dUTP（DIG-dUTP）各1μL，加入18μL标记缓冲液中并混匀。去除切片上多余液体，加标记液20μL/片。把样品置于湿盒中，37℃标记2 h。加封闭液50μL/片，室温30 min后去除封闭液。用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体，混匀后50μL/片加至标本片上。在湿盒中，37℃反应30 min。同样的操作处理链霉亲和素-过氧化物（SABC）。每步结束后均用0.01M TBS洗涤。采用DAB显色：染色步骤及结果判定同2.3中DAB显色。

7. RT-PCR半定量分析。应用Trizol按说明提取100 mL培养瓶中培养的转染细胞的总RNA，并逆转录成cDNA。以β-actin作为内参照，PCR法检测Bcl-XL、AKt、caspase-3、caspase-9等基因的表达情况。PCR反应条件：94℃预变性5 min，30个循环（94℃ 30s→55℃ 30 s→72℃ 1 min），最后72℃延伸10 min。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，利用GIS数码凝胶成像系统拍照并测定电泳条带灰度值，以目的基因与内参β-actin条带灰度比值表示其含量。

8. Western blot 检测。转染后的各组细胞（分组同前），用蛋白刮子刮下，PBS洗涤，利用细胞蛋白裂解提取总蛋白，测定蛋白浓度（Bio-Rad），每组取50 μg蛋白分别经10% SDS-PAGE电泳分离，用Western blot 检测caspase-3及caspase-9蛋白表达情况。各组分别以对照组的目的蛋白与β-actin光密度的比值作为内参进行比较。

9. 统计学处理。数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，用SPSS 11.5统计软件分析，P<0.05。

二、结果

（一） hERβ在PC-3M细胞内的表达

荧光显微镜下观察GFP的表达，同时应用免疫细胞化学染色法检测转染细胞中hERβ的表达。结果显示：与对照组比较，转染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M细胞，GFP表达阳性;免疫细胞化学实验结果显示，与对照组比较，转染ERβ的细胞，大部分呈阳性染色，尤其是细胞核棕黄色染色明显。

（二） hERβ促进PC-3M细胞凋亡

1.流式细胞技术检测。结果显示：转染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M细胞的实验组与对照组相比，在G1前出现了亚二倍峰，即为凋亡峰。凋亡细胞数目占总细胞数的13.7%，凋亡细胞明显增加。

2. 吖啶橙实验。吖啶橙实验结果显示：实验组细胞出现了被染为桔黄色的凋亡细胞;而对照组细胞则偶见被染为桔黄色的凋亡细胞。说明转染pEGFP-C1-hERβ质粒可促进细胞发生凋亡。

3.TUNEL检测。TUNEL实验结果显示：与对照组相比，转染pEGFP-C1-hERβ的细胞，出现阳性染色，胞核呈深棕黄色。细胞大小不一，结构不完整，可见胞质凝缩，核断裂相。

（三） RT-PCR检测

琼脂糖凝胶电泳结果显示：与对照组相比，实验组细胞未见抗凋亡基因Bcl-XL表达;而AKt的表达明显减少;凋亡基因caspase-9的表达则增加，而caspase-3的mRNA表达减少。

（四）Western blot 检测

Western blot结果显示：与对照组相比，转染pEGFP-C1-hERβ的PC-3M细胞，可见17 KD的caspase-3片断，和37 KD的caspase-9片段。提示转染细胞中caspase-3和caspase-9的活化。

三、讨论

Bardin等研究证明，转染ERβ到卵巢癌细胞后，可引起细胞凋亡。Cheng等把ERβ基因转染到前列腺癌细胞株DU145中，细胞增殖抑制，诱导细胞出现凋亡。因此推测ERβ可能是一种肿瘤抑制基因，研究ERβ对前列腺癌细胞凋亡途径的影响，对前列腺癌患者的治疗具有重要的研究意义和临床应用价值。本实验显示ERβ转染PC-3M细胞后，经流式细胞仪检测发现，细胞在G1期前出现凋亡峰;镜下可见细胞核内染色体边集，呈新月形或马蹄形分布。上述实验指标证明，ERβ转染PC-3M细胞后，诱发细胞出现凋亡。

细胞凋亡调控机制的核心是一类蛋白水解酶，统称为天冬氨酸蛋白酶（cysteine-requiring aspartate protease，caspase）家族。caspase-3是凋亡过程中激活的关键激酶，也是凋亡的主要效应因子。caspase-9与caspase-3一样，也可以把PARP剪切成85KD的小片段。western blot结果显示：转染ERβ的细胞，caspase-3及caspase-9表达明显增加（P<0.05），实验结果具有统计学意义。

Bcl-XL是B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白（B-celllymphoma/leukemia-2protein，Bcl-2）Bcl-2家族中的重要成员。Bcl-X基因可翻译Bcl-XL和Bcl-Xs两种蛋白，Bcl-XL比Bcl-Xs多出一個BH4结构域，可抑制细胞凋亡，而Bcl-Xs则促进细胞凋亡。研究表明Bcl-XL可通过多条途径发挥抗凋亡作用：通过稳定线粒体膜电位、阻止线粒体释放凋亡诱导因子，阻抑caspase的级联放大效应等。激活后的Akt通过对含有丝氨酸&苏氨酸残基的底物磷酸化而发挥广泛的生物学效应。PCR结果显示：转染ERβ的PC-3M细胞，Bcl-XL和AKt的表达明显降低。

综上所述， ERβ引起前列腺癌细胞发生凋亡的可能机制是： ERβ的增加抑制AKt和Bcl-XL基因的活性，使之丧失抑制Apaf-1的功能;促进细胞色素C（Apaf-2）从线粒体内释放并与Apaf-1结合;进而促进caspase-9（Apaf-3）与之结合并激活，启动细胞凋亡级联反应，导致细胞形态学发生改变及核小体间的DNA降解等一系列变化。