薰衣草DXS基因的克隆、表达分析及原核表达

龚林涛，苏秀娟，尹松松，孙明辉，闫博文，阿迪莱·阿布都热依木,陈全家

(新疆农业大学农学院 / 新疆农业大学农业生物技术重点实验室，乌鲁木齐 830052 )

0 引 言

【研究意义】薰衣草为唇形科薰衣草属(Lavandula)。我国主要栽培的薰衣草种有狭叶薰衣草(LavandulaangustifoliaMil1.)、阔叶薰衣草(LavandulalatifoliaVill.)、杂薰衣草(Lavandulaxintermedia)[1]。新疆是薰衣草的主要种植地区，薰衣草花穗提取的精油具有抗菌、镇静、助眠、缓解疼痛等功效[2]，被广泛应用于日化用品、化妆品、香薰等领域。薰衣草精油由多种化合物组成，其中萜类化合物占比最高，其主要组分为芳樟醇、乙酸薰衣草酯、乙酸芳樟酯、1,8-桉叶醇、罗勒烯、樟脑等单萜类化合物[3]。植物的萜烯类物质的合成有2个途径，一个是存在于胞质中的甲羟戊酸(MVA)途径[4]，另一个是存在于质体上的甲基赤藓糖醇途径(MEP)[5]，而单萜类化合物主要由MEP途径合成[6]。DXS是催化MEP途径第一步反应的重要限速酶，催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛合成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸(1-deoxy-Dxylulose-5-phosphate，DXP)[7]。DXS在植物萜类产物的形成和代谢中起到重要作用。揭示DXS基因在薰衣草萜类物质合成过程中的调控作用，可为利用转基因技术培育优质薰衣草品种提供理论基础。 【前人研究进展】Jiang R[8]构建可产生拟紫罗兰酮的菌株时，向大肠秆菌中转入含有DXS基因的重组质粒，使拟紫罗兰酮的产量增加了8.34倍。Berry[9]发现DXS基因转录水平与类胡萝卜素的积累有直接关系，从而影响辣椒的颜色强度。共表达烟草DXS基因和SPS(茄尼基焦磷酸合酶)基因，转基因植株茄尼醇的含量最高提升了3倍左右，苗期DXS基因表达量最高是对照的10.2倍[10]。Vaccaro等[11]发现，过表达蓝细菌DXS基因可使丹参菌核毛根部产生大量的生物活性二萜，其中衣索酮的产量提高了3倍左右。Wei Hui等[12]将胡杨PtDXS基因导入白杨树中发现：相比野生型，转基因白杨中脱落酸和赤霉素含量较高。DXS基因除具有可以调控萜类代谢的功能，还与植物抗病性有关[13]。 【本研究切入点】DXS基因在萜类合成代谢中具有重要的作用，目前在薰衣草萜类合成代谢过程中的调控作用尚未报道。研究DXS基因分子特性和表达模式，了解其在薰衣草萜类合成代谢过程中的调控作用，揭示其在薰衣草萜类代谢途径上的分子机理。 【拟解决的关键问题】以高油薰衣草品系杂花为材料，克隆并分析DXS基因，比较DXS基因在低油薰衣草品系法国蓝和高油薰衣草品系杂花的花器官的时空表达，并对该基因进行原核表达分析。系统分析DXS基因分子特性以及表达特性，研究该基因在薰衣草萜类代谢通路中的调控机制，为培育优质薰衣草品种提供优异基因资源和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 薰衣草

试验以新疆伊犁地区种植的薰衣草品系杂花和法国蓝为材料。

1.1.2 载体和试剂

pET-28a(+)、pCAMBIA1304保存于新疆农业大学生物技术重点实验室；大肠秆菌DH5α感受态、pEASY-T5 Simple Cloning Kit 、TransStart®FastPfu Fly DNA Polymerase、TransStartTip Green qPCR SuperMix (+Dye I)、ProteinRuler®II、Transetta(DE3)感受态购自北京全式金生物技术有限公司；多糖多酚植物总RNA提取试剂盒、普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司；核酸染料、农秆菌GV3101感受态购自北京博迈德生物技术有限公司；2×TaqMaster Mix、MarkerⅦ、Marker 15 000购自北京酷来搏科技有限公司；反转录试剂盒、限制性内切酶NdeⅠ、EcoRⅠ、T4DNA 连接酶购自赛默飞世尔科技有限公司；引物合成和测序由昆泰锐生物技术有限责任公司完成。LB培养基：每升培养基含胰蛋胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，固体培养基含琼脂15 g。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆

根据NCBI公布的狭叶薰衣草1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶核苷酸序列(登录号：JX630150.1)，设计特异性引物(F1: ATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R1: TTAAGATGACAGGTTGATGAAACG)。提取杂花叶片RNA反转录为cDNA作为模板，扩增该目的基因。反应体系：cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，2.5 mM dNTPs 5 μL，10×EasyPfuBuffer 5 μL，EasyPfuDNA Polymerase 1 μL，water 36 μL。反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 40 s，72℃ 2 min，35个循环，72℃ 10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收后，用pEASY-T5载体连接，菌液PCR鉴定阳性克隆，送测昆泰锐生物技术有限责任公司。

1.2.2 生物信息学

利用生物信息学网络平台NCBI网站提供的Blastp程序对编码蛋白进行相似性搜索。使用ProtParam在线程序计算编码蛋白的理化参数。使用EMBL的InterProScan及Pfam对推导出的蛋白功能结构域进行预测。使用 PSIPRED在线工具预测该蛋白质的二级结构。使用SWISS-Model在线程序的自动模式对该蛋白的三级结构进行预测分析。使用Clustal X和MEGA 5.0完成多种氨基酸序列比对及相关蛋白的同源树构建。

1.2.3 表达模式

取杂花和法国蓝花器官不同发育时期的花冠：花蕾期、初开期、半开期、盛开期、衰败期；花器官盛开期的不同组织：花冠、花萼、萼片、雄蕊、雌蕊，提取RNA，反转录为cDNA；设计用于表达分析的特异性引物(F2: GCACGATGTGGACCTTCAGA、R2: CCGCCCGGTCCATCA；以β-Actin(F3: TGTGGATTGCCAAGGCAGAGT、R3: AATGAGCAGGCAGCAACAGCA)基因为内参，利用荧光定量PCR技术分析DXS基因在薰衣草不同品系花器官的不同发育时期及不同组织中的表达模式。

1.2.4 原核表达

设计含有NdeⅠ、EcoRⅠ酶切位点的克隆引物(F4: GGAATTCATATGATGGCGTCTTGTGGAGTTTT、R4: CGGAATTCAGATGACAGGTTGATGAAACG)，酶切扩增产物及pET-28 a(+)载体，琼脂糖凝胶电泳后回收纯化目的基因及线性载体，T4连接酶连接后转化DH5α，鉴定阳性克隆，送测昆泰锐生物技术有限责任公司，抽提质粒转化Transetta(DE3)感受态。活化50 μL pET-28 a(+)-DXS菌液至5 mL LB培养基中37℃，220 r/min，12 h，将活化菌液500 μL加入15 mL LB培养基中至OD600在0.4～0.6，1 mL使用含终浓度0、0.1、0.5、0.8、1、1.5和2 mM IPTG的LB培养基37℃诱导8 h，菌液沉淀使用120 μL去离子水重悬后加入30 μL 5×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10 min。

1.3 数据处理

使用DNAMAN软件对DXS基因序列进行分析，使用ProtParam在线程序对编码蛋白的理化参数进行分析，使用EMBL的InterProScan及Pfam在线预测软件、PSIPRED在线预测软件、SWISS-Model在线程序对DXS蛋白结构进行预测，使用Clustal X和MEGA 5.0完成多种氨基酸序列比对及蛋白同源树构建，使用Excel 2013、GraphPad Prism对DXS基因在杂花、法国蓝花器官不同发育时期、不同组织的实时荧光定量PCR数据进行分析和作图。

2 结果与分析

2.1 DXS基因克隆

以薰衣草杂花cDNA为模板，扩增出DXS基因。杂花DXS基因的ORF长2 181 bp，编码1条由726个氨基酸组成的蛋白质序列。使用ProtParam在线程序计算杂花DXS基因编码蛋白的理化参数。研究表明，该蛋白质等电点为6.57，分子量约为78.39 KDa。图1

注：M：Marker Ⅶ；1：PCR扩增Note: M: Marker Ⅶ; 1: PCR amplification图1 DXS基因扩增电泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DXS gene

该蛋白质序列含有DXP_synthase_N结构域、Transket_pyr和Transketolase_C结构域，预测该蛋白属于TPP_enzyme超家族成员、Transketolase_C超家族成员。图2

图2 DXS蛋白的功能结构域Fig. 2 Conserved domains in DXS protein

DXS蛋白二级结构包含29个β-折叠和20个α-螺旋。使用SWISS-Model在线程序的自动模式对DXS蛋白的三级结构进行预测分析。发现该蛋白三级结构中含有GCC元件结合结构域(SMTL ID 2o1x.1 B)，相似性达到41.31%以上。图3

图3 DXS蛋白二级结构预测Fig. 3 Predicted secondary structure of DXS protein

狭叶薰衣草(Lavandulaangustifolia)、冬凌草(Isodonrubescens)、毛喉鞘蕊花(Plectranthusbarbatus)、一串红(Salviasplendens)、鼠尾草(Salviaofficinalis)、丹参(Salviamiltiorrhiza)、野茶树(Camelliasinensis)、毛花连蕊茶(Camelliafraterna)、猕猴桃 (Actinidiachinensis)、万寿菊(Tageteserecta)中的DXS蛋白序列具有高度的保守性；构建相关蛋白的同源树，DXS蛋白和狭叶薰衣草、冬凌草、毛喉鞘蕊花DXS蛋白亲缘关系相近。图4～6

图4 DXS蛋白三级结构预测模型
Fig. 4 Predicted 3D structure model of DXS protein

注：图中分支点的数值表示Bootstrap 验证中基于1 000次重复的置信度Note: The numerical values of the branch points in the graph represent the confidence of the bootstrap validation based on 1,000 repetitions图5 DXS蛋白的系统进化树Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of DXS protein

图6 杂花DXS蛋白与其他物种DXS蛋白序列比对Fig. 6 Multiple alignment of amino acid sequences of DXS protein in Zahua

2.2 DXS基因的表达模式

研究表明，在2个品系花器官的不同发育时期和不同组织中均检测到了DXS基因的表达。

DXS基因在杂花花蕾期、初开期的表达量差异不显著(P>0.05)，初开期、半开期、盛开期、衰败期花冠表达量呈现显著递增的趋势；在法国蓝花蕾期、初开期、半开期、盛开期4个时期表达量不断上升，盛开期达到最高，衰败期开始降低。DXS基因在杂花花萼中表达量最高，在法国蓝盛开期雄蕊中表达量最高。图7，图8

图7 DXS基因在杂花和法国蓝花器官不同发育时期表达量Fig. 7 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different developmental stages

DXS基因在杂花和法国蓝花器官不同发育时期、不同组织相对表达量也存在差异。DXS基因在杂花不同发育时期的表达量均高于该基因在法国蓝不同发育时期的表达量；DXS基因在杂花的花冠、花萼、萼片的表达量均高于该基因在法国蓝以上组织中的表达量，而该基因在雄蕊、雌蕊中的表达量均低于在法国蓝中的表达量，DXS基因在杂花和法国蓝花器官不同发育时期、不同组织中的表达模式存在差异。图7，图8

图8 DXS基因在杂花和法国蓝花器官不同组织中表达量Fig. 8 Expression analysis of DXS gene in Zahua and French Blue flower organs at different tissues

2.3 DXS基因原核表达

EcoRⅠ、NdeⅠ 酶切鉴定构建的pET-28a(+)-DXS重组质粒，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，酶切后的小片段条带大小与目的基因大小一致，回收小片段产物后测序结果与目的序列一致，证明载体构建成功。将pET-28a(+)-DXS、pET-28a(+)空载体转化Transetta(DE3)感受态细胞，通过对不同时间、不同温度、不同诱导剂浓度的筛选进行表达体系优化，在37℃，诱导4 h，诱导剂IPTG浓度为0.8 mM时诱导量最大。图9,图10

注：M：Marker 15 000；1：pET-28a(+)-DXS质粒经NdeⅠ、EcoRⅠ双酶切；2：pET-28a(+)-DXS线性质粒Note: M: Marker 15,000; 1: pET-28a(+)- DXS digested by double enzyme NdeⅠ and EcoRⅠ;2: pET-28a(+)-DXS Linear plasmid图9 原核表达载体 pET-28a(+)-DXS双酶切鉴定Fig. 9 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

注：M：蛋白ProteinRuler Ⅰ ；1：pET-28a(+)未诱导；2：pET-28a(+)诱导后；3：pET-28a(+)-DXS蛋白诱导前；4：DXS蛋白未诱导；5：DXS蛋白诱导后Note: M: ProteinRuler Ⅰ; 1: Transetta with pET-28a(+) uninduced; 2: Transetta with pET-28a(+) induced by IPTG; 3: Transetta with pET-28a(+)-DXS before induction; 4: Transetta with pET-28a(+)-DXS uninduced; 5: Transetta with pET-28a(+)-DXS by IPTG图10 DXS重组蛋白原核表达Fig.10 Prokaryotic expression analysis of recombinant DXS protein

3 讨 论

DXS作为催化MEP途径第1步反应的重要限速酶，在植物萜类代谢中起到至关重要的作用，对DXS基因家族的研究引起了广泛关注。研究表明，不同植物中DXS基因家族成员的数目各不相同，如雷公藤有2个DXS基因，沉香和拟南芥有3个DXS基因[14-15]，胡萝卜(Daucus carota)[16]有5个DXS基因，烟草仅在茄尼醇合成途径上就发现6个DXS基因[17]。研究目前仅从杂花薰衣草中克隆出1条DXS基因。

近10年来约有200个植物的DXS基因相继被国内外学者克隆，并对DXS基因的基因序列和蛋白结构进行了分析。研究中杂花DXS基因的蛋白含有726个氨基酸，与报道中大多数植物的DXS蛋白含有691～738个氨基酸的结论一致[18]。杂花薰衣草的DXS蛋白结构高度保守，其对应编码的氨基酸序列与已登录NCBI的狭叶薰衣草DXS氨基酸序列比较发现，杂花DXS在第510个氨基酸处多出1个脯氨酸，且杂花DXS全序列共有8处氨基酸序列存在差异。杂花的DXS与大多数植物DXS具有相同的特点，蛋白系统进化树分析表明，杂花的DXS蛋白与狭叶薰衣草DXS蛋白一致性最高，其次与唇形科香茶属的冬凌草、唇形科鞘蕊属毛喉鞘蕊花的DXS蛋白也有较高的一致性，而与菊科万寿菊属的万寿菊DXS蛋白一致性最低，DXS同源蛋白序列间的差异，可能使其在不同物种中行使不同的生物功能。根据PredictProtein、TargetP蛋白在线预测软件预测，亚细胞定位预测杂花DXS蛋白定位在叶绿体上，这与MEP途径位于质体上的报道一致。

DXS基因表达水平与品种有关，并具有组织差异性[19]。张浩宇等[20]发现DXS基因在香味越浓的百合品种中表达量越高；徐燕[21]发现5个不同茶树品种叶芽中的DXS基因的表达量也有差异。Xu Chen等[22]在木本植物胡杨中发现，PtDXS在叶片中表达水平最高，在根中表达水平最低，乌头[23]中AbDXS1基因，熊胆草[24]中CbDXS基因在叶片中的表达水平也高于在根中的表达水平。王辉等[25]发现，红豆杉中的TcDXS在嫩叶柄表达最高，叶、皮次之，根、茎最低。DXS基因表达水平与组织发育程度也有关系，郭亚飞[26]发现，茶树CsDXS1基因在叶片的不同发育时期存在表达差异，嫩叶中表达水平更高；郑丽屏等[27]发现，黄花蒿DXS基因的表达水平花期植株显著高于营养期植株。研究中，DXS基因在杂花、法国蓝2品系中不同发育时期、不同组织中均有表达；在衰败期杂花的表达量呈现上升的趋势，法国蓝的表达量呈现下降的趋势；而从DXS基因在杂花不同发育时期、不同组织的表达量均高于法国蓝，初步判断DXS基因表达与薰衣草精油产量存在正相关关系。

DXS基因家族中每一条DXS可能仅作用于一个或几个萜类成分的生物合成途径，如Fangyuan Z 等[28]从青蒿中克隆DXS基因(AaDXS1、AaDXS2、AaDXS3)，发现AaDXS2在特定组织中的表达模式与青蒿素合成的表达模式相似，并推测AaDXS2是合成青蒿素途径中的唯一一个DXS家族成员。据报道，DXS基因对薰衣草萜类成分合成途径存在影响，Isabel[29]通过转化宽叶薰衣草，将DXS基因与催化MEP途径第2步的关键酶基因DXR(1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原酶)的功能进行比较，证明了DXS基因对萜类成分合成途径的调控作用更为明显；拟南芥DXS基因导入宽叶薰衣草基因组后发现转基因植株叶片和花朵中精油产量比对照显著提高[30]。

利用原核体外表达进行基因功能的验证具有操作简单、周期短的优点。冯国庆[31]对紫杉醇的TCDXS基因构建了原核表达载体，并成功在Transetta (DE3)中表达。Wei Hui等[12]将PtDXS重组蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达纯化后进行活性评价，结果表明，纯化后的蛋白能够催化甘油醛-3-磷酸和丙酮酸形成1-脱氧-d-木酮糖-5-磷酸(DXP)。研究构建了薰衣草DXS基因原核表达载体，并成功进行了诱导，但是由于大肠杆菌的密码子偏好性，外源基因DXS在Transetta中表达量不高，且容易降解。研究成功诱导得到含有组氨酸标签的DXS蛋白，为后期该蛋白的纯化和复性打下基础，也是构建体外酶活体系鉴定杂花薰衣草DXS蛋白功能的前提。

4 结 论

DXS基因表达量与薰衣草精油产量存在正相关关系，薰衣草DXS基因可能是调控薰衣草萜类代谢物合成的限速酶；建立了DXS基因的原核表达系统。