甘肃民勤黑枸杞干果提取液抑菌性及抗氧化性分析

刘秀丽 王春林 易斌 武芸 康亚青

摘要采用乙醇提取法外加超声波辅助，探究不同条件下黑枸杞提取液对常见致病菌（包括大肠埃希氏菌E.coli、金黄色葡萄球菌S.au、肠炎沙门氏菌S.en）的抑菌效果，并在最佳抑菌效果的提取条件下，采用DPPH法测定提取液的抗氧化能力。结果表明：超声时间30 min，超声频率60 Hz，浸提温度25 ℃，料液比1∶15（g∶mL），乙醇浓度60%时，提取液抑菌性能最佳。尤其对S.en抑菌效果最好，最低抑菌浓度为0.125 g/mL。在上述提取条件下，黑枸杞提取液对自由基的清除率随浓度的增大而显著增大，具有明显的量效关系，溶液浓度在600 μg/mL以上时，黑枸杞提取物对自由基的清除率高于同浓度下的VC水溶液，最大清除率可达76.26%。说明黑枸杞浸提液具有明显的抑菌效果和较强的抗氧化性。

关键词黑枸杞;提取液;抑菌性;抗氧化

中图分类号TS255文献标识码A 文章编号0517-6611（2020）15-0180-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.15.052

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Antibacterial and Antioxidant Activities of Lycium ruthenicum Murr.Extracts in Minqin，Gansu Province

LIU Xiuli1，2，WANG Chunlin1，2，YI Bin1 et al

（1.University Provincial Key Laboratory for Protection and Utilization of Longdong Bioresources in Gansu，Qingyang，Gansu 745000;2.College of Life Science and Technology，Longdong University，Qingyang，Gansu 745000）

AbstractUsing ethanol extraction and ultrasonic assisted methods to explore the antibacterial effects of Lycium ruthenicum Murr. extracts under different conditions on common pathogens [including Escherichia coli（E.coli），Staphylococcus aureus（S.au），and Salmonella enteritidis（S.en）].Under the best antibacterial effect， the DPPH method is used to determine the antioxidant capacity of the extract.The results showed that when the ultrasonic time was 30 min， the ultrasonic frequency was 60 Hz， the extraction temperature was 25 ℃， the ratio of material to liquid was 1∶15（g∶mL）， and the ethanol concentration was 60%， the extract had the best antibacterial performance. In particular， it had the best antibacterial effect on S.en， with a minimum inhibitory concentration of 0.125 g/mL.Under the above extraction conditions， the scavenging rate of L. ruthenicum on free radicals increased significantly with the increase of the concentration， which had an obvious effect and dose relationship.When the solution concentration was above 600 μg/mL， the scavenging rate of L. ruthenicum extract on free radicals was higher than that of the Vc aqueous solution at the same concentration， and the maximum scavenging rate can reach 76.26%.It shows that the L. ruthenicum extract has obvious antibacterial effect and strong antioxidation.

Key wordsLycium ruthenicum Murr.;Extract;Antibacterial activity;Oxidation resistance

基金項目甘肃省高等学校科研项目（2008A-099）;甘肃省自然科学基金项目（18JR3RM235）;陇东学院科技创新项目（XYZK1901）;甘肃省高等学校科研项目（2017B-63）。

作者简介刘秀丽（1979—），女，河北承德人，副教授，硕士，从事植物学研究。

收稿日期2020-04-07;修回日期2020-04-26

黑枸杞是茄科植物黑枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）的果实，主要分布于中亚地区，如中国、巴基斯坦、印度等国家。该植物是多棘刺灌木，浆果紫黑色，球状，种子肾形，褐色，花果期5—10月[1]。由于黑枸杞具有较强的适应能力，在恶劣的荒漠环境中依然能够顽强生长，因此常见于盐碱土和沙土等较为不利的土地环境中，其具有独特的储盐机理因而对盐碱土有改良作用，是自然界中一类兼具经济价值和生态效益的高价值植物。在我国，黑枸杞生长分布于甘肃、青海、宁夏等西北地区，其在生态修复方面具有特殊的优势，较为繁盛的根系以及强大的生存能力能有效地保持水土，耐盐碱性可发挥改善盐碱地的作用，较强的光合能力以及逆境中的生存能力利于防风固沙[2]。

除具有生态环境保护作用，黑枸杞中含量颇高的营养成分，如氨基酸、矿物质、维生素以及枸杞多糖、酚类、黄酮类等生理活性物质，使其在药品、保健品、食品等行业拥有较大的发展潜力。对于枸杞的药用价值，历来有所记载，经典的医学著作《晶珠本草》上就记载枸杞具有治疗冠心病、月经失调等疾病的作用。近些年，越来越多的人注意到黑枸杞的营养价值，其中黑枸杞兼备蓝莓的花色苷成分和红枸杞的多糖成分，研发应用领域广泛。随着日益增长的需求以及研究向纵深处扩展，关于黑枸杞的产品将具有广阔的发展空间[3]。

当代研究表明，黑枸杞中氨基酸类型多样，例如甲硫氨酸、苯丙氨酸等含量较高[4]。王紫薇[5]通过有机溶剂提取法研究提取液中各成分的含量以及活性，最终结果显示黑枸杞提取液中酚类物质和黄酮类物质含量为45.05、56.54 mg/g，多糖成分为7.83%，VC含量为99.0 mg/kg。黑枸杞中研究最多、应用前景最广的物质为花青素。目前研究证明花青素具备多种生理活性，如抗氧化、抗炎、抗心血管疾病及防癌等[6]。

该研究以甘肃民勤黑枸杞为原材料，通过检测黑枸杞提取液对常见致病菌[包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.au）、肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，S.en）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli）]的抑菌能力，优化提取条件，并以自由基清除率为指标测定提取液在该条件下的抗氧化性，以期为黑枸杞的充分利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料

黑枸杞来自于甘肃省民勤县，随机采摘，果实均在40～45 ℃烘干24 h，再于45～50 ℃下烘至恒重。致病菌来源：由庆阳市疾控中心实验室提供并于陇东学院微生物实验室保存。

1.2仪器与试剂

立式高压蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、超净化工作台（上海苏净实业有限公司）、隔水式恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;超声波清洗器（昆山禾创公司）;冷冻离心机（德国SIGMA公司）;旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）;紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉、VC、DPPH、无水乙醇等试剂均为国产分析纯，购于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3试验方法

1.3.1抑菌性分析。

参照前人[7]研究，制作带有细菌培养基的方法为倾注法，即在50 ℃左右的固体培养基中加入一定量预先活化的菌液，充分振荡混合均匀后立即倒平板，倒好的平板正置等待凝固;在平板上打孔后向孔中加入定量的无菌提取液，之后将培养基置于4 ℃冰箱中预扩散2 h形成扩散圈，37 ℃培养后观察。

1.3.2黑枸杞提取液浸提条件的优化。

该试验采用有机溶剂外加超声波辅助法浸提黑枸杞，以有机溶剂45%、60%、75%乙醇为梯度，料液比1∶10、1∶15、1∶20（g∶mL），提取温度25、40、55、70 ℃，超声频率40、50、60、70 Hz，提取时间10、20、30、40、50 min等，获取枸杞浸提液，对致病菌进行抑菌试验，通过抑菌效果及单因素及正交试验分析，筛选黑枸杞抑菌成分的最优提取方法。

1.3.3提取液最低抑菌浓度及抑菌持续时间测定。

确定最佳提取条件后，采用二倍稀释法对提取液进行稀释，分别对常见致病菌S.au、S.en、E.coli进行抑菌试验，观察并测量抑菌圈大小、持续时间及最低抑菌浓度。

1.3.4黑枸杞提取物抗氧化性分析。

DPPH是一种在体外非常稳定的具有较深颜色的自由基，黑枸杞提取液中的某些物质可捕获DPPH进而使溶液颜色变化，这种变化可通过分光光度计被量化，因此DPPH常被用于溶液抗氧化性的检测[8]。该试验参照蔺瑞等[9]的方法，将黑枸杞提取物、VC配制成2.0 mg/mL的溶液，DPPH溶液浓度为0.4 mg/mL，并在暗处保存。溶液配制完成后，取5支試管，按表1所示快速加入相应溶液。之后在避光黑暗处放置 30 min充分反应，此为试验组。将DPPH溶液替换为等量的无水乙醇作为空白组，对照组将待测液替换为等量的无菌水，迅速在517 nm 处测定吸光值，之后再做2组平行对照。以平均值作为结果按下式计算清除率：

清除率= [A1-（A2-A3）] /A3×100%

式中，A1为对照组的吸光值;A2为试验组的吸光值;A3为空白组的吸光值。

1.3.5数据处理。

所有试验均采用3组平行对照，使用SPSS 20.0对数据进行分析，所有结果均用平均值±标准差（Mean±SD）表示。

2结果与分析

2.1黑枸杞提取液浸提条件的优化

通过在不同梯度乙醇浓度、提取时间、料液比、超声频率、提取温度下获取黑枸杞提取液，根据抑菌圈大小及抑菌时间长短对结果进行单因素分析，结果表明超声时间30 min，超声频率60 Hz，浸提温度25 ℃，料液比1∶15，乙醇浓度60%时，提取液抑菌性能最佳。

2.2提取液最低抑菌浓度及抑菌时间测定

2.2.1提取液最低抑菌浓度测定。

确定抑菌效果最佳的提取条件后，制备终浓度为1 g/mL的无菌提取液，以二倍稀释法分别获得浓度为0.5、0.25、0.125、0.062 5的滤菌提取液进行抑菌试验，记录提取液对S.au、S.en、E.coli的抑菌效果。由表2可知，提取液对S.au、S.en、E.coli的最低抑菌浓度分别为0.25、0.125、0.5 g/mL，对S.au和S.en的抑菌圈直径随着提取液浓度的降低而显著降低，说明提取液浓度对抑菌性能具有显著性的影响。在相同提取条件下，相对于其他2种菌，提取液对S.en的抑菌效果最佳，上述病菌对提取液敏感性的大小依次是S.en>S.au>E.coli。

2.2.2抑菌持续时间测定。

在上述研究基础上，记录提取液对S.au、S.en、E.coli的抑菌持续时间。由表3可知，在相同初始浓度提取液作用下，对S.au、S.en抑菌持续时间相当，对E.coli抑菌作用时间较短，随着提取液浓度降低，抑菌圈持续时间皆显著缩短直至失去抑菌作用，但对比结果表明，黑枸杞提取液对S.au具有更强的作用效果。

2.3提取液抗氧化测定

以新鲜干黑枸杞为材料，用上述方法获得提取液，以VC水溶液为对照进行抗氧化研究，由表4可知，黑枸杞提取液对自由基的清除率随浓度的增大而显著增大，具有明显的量效关系，当浓度高于600 μg/mL时，提取液对自由基的清除率高于同浓度下的VC，最大清除率可达76.26%。综合比较可知，黑枸杞提取物具备较强的抗氧化活性。

3讨论

刘如运[10]采用多种方法进行体外抑菌试验，最终得出结论：用涂布法制备含菌平板、平板打孔法进行抑菌试验效果较好。该试验实际操作过程中，采用涂布法制备含菌平板虽然操作简单，但在后续操作过程中发现，平板上的细菌容易生长不均匀，细菌或成片成片长成菌苔或零零落落非常稀疏，这会对抑菌圈大小判断造成巨大误差，且试验重复性差。采用倾注法获得含有细菌的平板，只要注意控制温度，勿使加入的细菌被烫死，充分振荡，即可制备良好的含菌平板。对于抑菌试验，平板打孔法简便快速，易于观察，效果良好。此试验选择的3种供试菌是生活中容易接触到的胃肠道病菌，所以用这些菌种作为抑菌对象具有广泛的实际价值，提取液扩散形成的抑菌圈直接简单地展示了对细菌的抑菌性能。高春燕等[11]得出，对于E.coli、S.au，枸杞多糖对它们的抑菌效果无显著性差异。在该试验中，对E.coli、S.au的抑菌圈却具有明显差异，说明枸杞提取液中不仅存在多糖这种抑菌物质，而且存在其他相关生理活性成分，其对E.coli也具有抑菌性。关于黑枸杞提取液的抗菌机制，相关资料研究表明具有两种可能性，其一为枸杞提取液中枸杞多糖含量丰富，这些多糖结合在菌体表面后，一方面快速地打破细菌屏障结构，如最外层的细胞壁以及柔韧的细胞膜，进而使细菌内物质外流而死亡，另一方面阻挡营养物、相关代谢产物正常进入菌体内，使细菌因不能吸收营养物质而“渴死”或进入休眠状态，最终达到抑菌的目的[12]。其二是枸杞提取液中的生理活性物质如甜菜碱以及单宁类、酚酸类、黄酮类物质具有使细菌细胞膜蛋白失活的作用，之后其他物质可以结合细菌的DNA，在遗传水平上改变细菌的生理性状，抑菌细菌生长[13]。

枸杞提取液抗氧化性测定结果显示，当溶液浓度高于600 μg/mL时，黑枸杞提取液对DPPH自由基的清除率要明显高于VC水溶液。研究表明，枸杞中富含多酚、枸杞多糖、花青素等活性成分。黑枸杞被称为“软黄金”的原因之一是枸杞中的花青素是所有植物花青素中功效最佳的。从本质上来说，花青素是一种对自由基亲和力强、反应迅速、抗氧化效果显著的化学物质，它具备清除对人体具有氧化损伤作用的氧自由基、羟基自由基等作用[14]。推测花青素可能是黑枸杞抗氧化能力的主要来源。

参考文献

[1] 中国科学院《中国植物志》编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1993：18.

[2] 王倩宁.黑果枸杞的研究进展[J].食品界，2018（4）：69.

[3] 李琳.黑果枸杞研究进展[J].农民致富之友，2018（14）：97.

[4] 矫晓丽，迟晓峰，董琦，等.柴达木野生黑果枸杞营养成分分析[J].氨基酸和生物资源，2011，33（3）：60-62.

[5] 王紫薇.黑果枸杞提取物抗氧化性研究及对HepG2细胞氧化损伤的保护作用[D].扬州：扬州大学，2016.

[6] 双全，张海霞，卢宇，等.野生黑果枸杞化学成分及抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2017，38（4）：94-100.

[7] 马建凤，刘华钢，朱丹.中药体外抑菌研究的方法学进展[J].药物评价研究，2010，33（1）：42-45.

[8] 楊丰绮，胡铁军，唐玉娇，等.黑枸杞提取物与红枸杞提取物抗氧化效果的比较[J].江苏调味副食品，2018（1）：31-33.

[9] 蔺瑞，张美莉，张家超.裸燕麦球蛋白的分离纯化及其抗氧化活性研究[J].食品科学，2011，32（1）：31-34.

[10] 刘如运.几种常见抑菌试验方法的评价及比较[J].现代企业教育，2013（14）：341-342.

[11] 高春燕，蒋丽珠，田呈瑞.枸杞多糖抑菌活性研究[J].食品科技，2007（10）：100-102.

[12] 季堯虎，窦华亭，吴厚玖，等.低聚糖抗菌活性的研究进展[J].食品科学，2016，37（13）：237-242.

[13] 梁文红.茶多酚抗菌作用的研究概况[J].国外医学（口腔医学分册），2004，31（S1）：26-28.

[14] 崔逸，蒋彩云，张翔，等.黑枸杞中抗氧化物质的提取及花青素含量分析[J].食品研究与开发，2017，38（16）：28-32.