巨细胞病毒对植入聚甲基丙烯酸甲酯小鼠部分免疫指标的抑制作用

江 蓉，张齐梅

(1. 四川省阿坝藏族羌族自治州人民医院口腔科， 阿坝藏族羌族自治州 624000；2. 西南医科大学附属口腔医院牙周黏膜科， 泸州 646000)

科学技术的飞速发展，使得越来越多的医用生物材料进入了口腔临床和颌面部修复的领域。相对于传统的金属或者非金属陶瓷材料，新型生物材料具有很强的抗冲击性和抗摩擦性，在使用过程中磨损率也很低[1]。目前高分子材料是各种口腔科生物医学材料的首要选择[2]。聚甲基丙烯酸甲酯（polymethyl methacrylate, PMMA）具有透明性极好、强度高、耐光老化和质轻坚韧等优良特点。近期的研究发现PMMA 植入后，其细胞毒性和对机体免疫系统的影响均很小，因此被认为是牙修复材料很好的选择[3-4]。巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）是一种常见的机会性感染病毒，在人群中感染非常普遍，与口腔溃疡和急性牙周炎等口腔疾病的发生紧密相关[5-7]。然而，CMV感染对口腔生物材料植入后免疫系统的作用，目前研究还很少。

1 材料与方法

1.1 实验动物、试剂与仪器

SPF 级雄性BALB/c 小鼠45 只，4 周龄，体质量12～15 g ，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK（京）2016-0011]；CMV 购自生工生物工程（上海）有限公司，将CMV 进行10 倍稀释后定量接种细胞，按Reed-Muench法计算病毒致半数细胞感染量（50% tissue culture infective dose, TCID50）为105U/0.1 mL；PMMA购自上海众荣新材料科技有限公司；小鼠淋巴细胞分离液购自天津TBD 公司；CD68、CD206、CCR7、CD3、CD4、CD8、CD25 和Foxp3 抗体均购自美国BD 公司；肿瘤坏死因子-α(TNFα)和白细胞介素-1β(IL-1β)的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒均购自欣博盛生物科技有限公司；流式细胞仪购自美国BD 公司；酶标仪购自美国Biotek 仪器有限公司。

1.2 动物模型的构建[8]

本实验在西南医科大学口腔医院实验中心内开展[SYXK(川)2018-213]，设施达到ABSL-2 级实验室相关生物安全要求。小鼠随机分为空白对照组（n=30）和病毒感染组（n=15）。病毒感染组于腹腔内接种106U/mL 的病毒悬液10 μL，建立CMV 感染小鼠模型，空白对照组以相同方法注射相同体积的生理盐水。模型建立7 d 后，在无菌操作下取小鼠尾静脉血0.1 mL，采用酶联免疫吸附试剂盒（南京建成生物研究所）检测CMV IgM 和IgG。CMV IgM、IgG 均阳性者判断为CMV 感染，即模型建立成功。建模7 d 后，模型组小鼠死亡2 只，造模不成功2 只，空白对照组30只小鼠和病毒感染组11只小鼠用于后续研究。

1.3 PMMA的植入

接种病毒后7 d，采用1%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，将0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的PMMA植入到小鼠背部皮下。小鼠共分为3 组：空白对照组15 只小鼠进行假手术，作为对照组；空白对照组小鼠15 只皮下植入PMMA，作为植入对照组；病毒感染组小鼠11 只皮下植入PMMA，作为植入CMV 组。植入PMMA 后7 d，对照组和植入对照组小鼠分别死亡2只，植入CMV组小鼠死亡1 只。

1.4 单核/巨噬细胞、T 细胞亚群及调节性T 细胞（Treg 细胞）的检测

小鼠植入PMMA 后7 d，采用1%的戊巴比妥钠麻醉小鼠，打开胸腔，暴露心脏，用针头刺入右心室，收集小鼠的心脏血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞。采用流式细胞术分别进行单核/巨噬细胞、T 细胞亚群及Treg 细胞的检测，三项检测对应的流式抗体分别是C D 68、CD206 和CCR7 抗体，CD3、CD4 和CD8 抗体，以及CD4 和CD25 抗体，均室温孵育20 min。采用流式细胞术分别检测M1 型单核/ 巨噬细胞（CD68+CCR7+细胞）和M2 型单核/巨噬细胞（CD68+CD206+细胞）的比例，CD4+T 细胞（CD3+CD4+细胞）和CD8+T 细胞（CD3+CD8+细胞）的比例，以及Treg 细胞（CD4+CD25+Foxp3+细胞）的比例。

1.5 炎性因子的检测

小鼠植入PMMA 后7 d，收集小鼠的心脏血，分离出血浆，ELISA 检测TNF-α 和IL-1β 的表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.6 统计学分析

使用SPSS 17.0 软件进行统计分析，实验结果以±s表示。组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CMV抑制小鼠植入PMMA后的M1型单核/巨噬细胞比例升高

流式细胞术结果显示，与对照组比较，植入对照组外周血中CD68+CCR7+M1 型单核/巨噬细胞的比例升高了44.63%（t＝2.794，P＝0.049），CD68+CD206+M2 型单核/巨噬细胞的比例降低了39.71%（t＝3.806，P＝0.019）；CMV 能够显著抑制PMMA引起的M1 型单核/巨噬细胞比例升高，与植入对照组比较，植入CMV组外周血中CD68+CCR7+M1 型单核/巨噬细胞的比例降低了73.18%（t＝5.896，P＝0.004），CD68+CD206+M2 型单核/巨噬细胞的比例则升高了2.18 倍（t＝7.971，P＝0.001）（图1）。

2.2 CMV抑制小鼠植入PMMA后CD4+/CD8+T细胞比值

流式细胞术结果显示，对照组与植入对照组外周血中CD4+/CD8+T 细胞比值没有明显差异（t＝1.564，P＝0.193）；CMV 能够显著抑制PMMA 植入后CD4+/CD8+T 细胞比值，相对于植入对照组，植入CMV 组外周血中CD4+/CD8+T细胞比值降低了42.91%（t＝6.468，P＝0.003）（图2）。

图1 CMV 抑制PMMA 引起的小鼠M1 型单核/巨噬细胞比例升高Figure 1 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the proportion of M1 monocyte/macrophage ratio in mice

图2 CMV 抑制PMMA 植入后小鼠CD4+/CD8+T 细胞比值Figure 2 Cytomegalovirus (CMV) inhibits the ratio of CD4+/CD8+T cells in mice after PMMA implantation

2.3 CMV促进PMMA植入后小鼠Treg细胞比例升高

流式细胞术结果显示，对照组与植入对照组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例没有明显差异（t＝0.464，P＝0.667）；CMV 能够显著促进Treg 细胞比例升高，相对于植入对照组，植入CMV 组外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞比例升高了2.49 倍（t＝4.495，P＝0.011）（图3）。

2.4 CMV抑制PMMA引起小鼠炎性因子含量的升高

ELISA 结果显示，相对于对照组，植入对照组外周血中TNF-α 和IL-1β 含量分别上升39.56%和46.78%（t＝2.897，P＝0.044 和t＝4.023，P＝0.016）；CMV 能够抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高，相对于植入对照组，植入CMV组外周血中TNF-α 和IL-1β 的含量分别降低了71.65%和57.95%（t＝7.236，P＝0.019 和t＝7.543，P＝0.002）（图4）。

图3 CMV 促进PMMA 植入后小鼠Treg 细胞比例升高Figure 3 Cytomegalovirus (CMV) promotes an increase of the proportion of Treg cells in mice after PMMA implantation

图4 CMV 抑制PMMA 引起的炎性因子含量升高Figure 4 Cytomegalovirus (CMV) inhibits PMMA-induced increase of the concentration of inflammatory factors in mice

3 讨论

目前，有大量的生物材料被应用于口腔医学领域，这些材料在应用于临床前需要经过各项生物性能检测，很多都具有良好的生物相容性和物理特性[9]。据统计，超过50%的人群感染CMV，在免疫力低下的情况下，CMV可引起多种口腔疾病，因此接受口腔植入物的患者至少有一半存在CMV 感染[10]。PMMA 是目前使用最多的高分子材料之一。本研究发现在正常生理情况下PMMA不会引起显著的炎性反应，适度的炎性反应有利于组织的修复及清除植入局部的病原微生物；然而在CMV感染的情况下，PMMA植入后CMV会显著抑制局部的免疫反应，这可能不利于损伤组织的修复。

单核/ 巨噬细胞是机体固有免疫的重要细胞，按照其表型可以分为M1 型和M2 型。M1 型单核/巨噬细胞是主要的炎性细胞，能够分泌炎性因子或者直接吞噬并清除植入物局部的坏死组织，此外还能启动组织局部的修复和血管生成。M2 型单核/巨噬细胞是抑制性细胞，能够分泌免疫抑制因子，抑制局部的炎性反应。研究发现PPMA 植入后，会轻微引起M1 型单核/巨噬细胞升高，降低M2 型单核/巨噬细胞，这有利于局部坏死组织的清除并抑制病原微生物的增殖[11-13]。然而CMV的感染会大大降低M1型单核/巨噬细胞比例，促进M2 型单核/巨噬细胞比例的升高，使得植入物局部成为一个免疫抑制的微环境，不利于坏死组织的清除，还可能引起局部感染的加重。

T细胞是机体细胞免疫的主要细胞，CMV感染会引起CD4+/CD8+T 细胞比值下降，Treg 细胞比例升高，使整个机体处于免疫抑制的状态。Treg 细胞是机体的主要免疫抑制细胞，能够通过分泌IL-10 和转化生长因子-β，促进病原微生物的逃逸，可能会引起或者加重机体的感染[14-16]。本研究发现，PPMA 植入后，CD4+/CD8+T 细胞比值以及Treg 细胞比例均没有显著变化。CMV感染会显著降低PPMA植入后CD4+/CD8+T细胞比值，而Treg 细胞比例则会显著升高，这使得材料植入局部免疫力十分低下，不利于坏死组织和病原微生物的清除。

本研究结果提示，CMV能够显著抑制PPMA植入后的免疫反应，可为CMV 感染患者口腔生物材料植入后的抗病毒治疗提供参考依据。