东莞地区慢性乙肝患者乙肝病毒基因分型及耐药性研究

朱梓年，谢小燕，罗秀霞，丁爱娇，张拔山

(东莞市人民医院检验科, 广东 中山)

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)有一个非常显著的特点，其属于逆转录病毒类型，病毒因子在逆转录过程中因缺乏校对酶作用，很容易产生碱基错配问题，进而累积形成多种基因型[1]。按照全基因序列同源性分类，乙型肝炎病毒包括B型、C型、D型等基因型，其分布有显著的地域性特征，且不同的基因型对乙肝的发生、发展以及预后有重要影响[2]。鉴于此，本文将对东莞地区乙型肝炎患者乙肝病毒的基因分型和耐药性进行检测，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年1月至2019年12月，选取在东莞市人民医院就诊的东莞地区的慢性乙型肝炎患者1175例，HBVDNA＞5.0IU/mL纳入标准：①患者均与中华医学会肝病学分会制定的《慢性乙型肝炎临床诊断标准(2015 年)》相吻合[3]；②患者均知情，同意参与本次研究。排除标准：酒精性肝病、代谢性肝病及其他病毒感染导致的肝病等。其中，男789例，女386例，患者年龄18-65岁，平均年龄(35.6±2.4)岁。

1.2 检验方法

采用深圳亚能公司提供的应用基因扩增以及采用膜反向杂交技术(PCR-RDB)的成品试剂盒进行血清检测，检测内容为基因分型和耐药突变情况。

晨起空腹抽取患者静脉血3mL，置于促凝管中进行4 000 r/min 离心10min，分离血清并及时放到-40℃冰箱保存备用。严格按照深圳亚能公司所提供的试剂盒说明书进行操作，采用离心柱法提取乙肝病毒DNA，使用珠海黑马HEMA 9600扩增仪进行扩增，PCR扩增条件设为：50℃ 2分钟，1 cycles；95℃ 10分 钟，1 cycles；94℃ 60秒，68 ℃ 90秒，30cycles ；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 30秒，30cycles ； 72℃5分钟，1 cycles。扩增产物加至含试剂盒膜条的杂交液中，在47℃环境中杂交1.5-4小时；洗膜，避光显色15分钟，结合蓝色斑点判读结果。

使用试剂盒膜条检测区分中国和其他亚洲国家乙型肝炎病毒常见的B型、C型、D型基因。rt180M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T六个突变位点。使用两种膜条检测耐药性，主要检测对拉米夫定、阿德福韦酯以及替比夫定的耐药性。

1.3 观察指标

1.3.1 统计上述乙肝患者乙肝病毒基因分型与突变分型。

1.3.2 统计B、C基因型对拉米夫定等常用药物耐药性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0数据处理软件进行综合处理，计数资料以百分数和例数表示，组间比较采用χ2检验；计量资料以均数±标准差，组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 上述乙肝病毒基因分型与耐药突变分型

1022例阳性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，东莞地区乙肝病毒基因分型以B型和C型为主。见表1。

表1 乙肝病毒基因分型

1022例阳性感染病例中，出现rt180M突变161例，占15.8%，出 现rt204V突 变117例，占11.4%，出 现rt204I突变157例，占15.4%，出现rt207I突变9例，占0.9%，出现rt181V突变15例，占1.5%，出现rt236T突变34例，占3.3%。rt180M突变、rt204V突变、rt204I突变发生几率最高。见表2。

表2 乙肝病毒突变点位

2.2 B、C基因型对拉米夫定等常用药物耐药性

B基因型发生拉米夫定耐药性15.5%、替比夫定耐药性15.5%，C基因型发生拉米夫定耐药性37.6%、替比夫定耐药性37.6%，差异有统计学意义，P＜0.05。见表3。

表3 B、C基因型对拉米夫定等常用药物耐药性分析

3 讨论

按照核苷酸序列的异源性不同，可以将乙型肝炎病毒分为A-J十大类型，乙型肝炎病毒的基因分型呈现明显的地域性特点，我国乙型肝炎病毒基因分型主要以B、C和D型为主[4]。有研究资料指出，我国南方地区的乙型肝炎病毒基因主要以B型为主，北方地区的乙型肝炎病毒基因以C型为主；汉族人群的乙型肝炎病毒基因以B型和C型为主，少数民族地区的乙型肝炎病毒基因A型和D型占比较多[5]。在本文研究的1022例乙肝阳性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，东莞地区乙肝病毒基因分型以B型和C型为主，这也与上述研究结果相吻合。

乙型肝炎病毒感染之后的转归会受到多方面因素的影响，其中乙肝病毒基因分型是非常重要的指标[6]。有研究指出，乙肝病毒C型基因多导致严重病变，而乙肝病毒B型基因多引起轻度病变。其原因可能为乙肝病毒C型基因病毒的复制性较强、毒株致病性较强，不容易出现e抗原转换，很容易出现持续的病毒血症甚至较为严重的肝脏病变[7]。同时，乙肝病毒C型基因患者预后较差，这与乙肝病毒C型基因病毒血症水平高、不易被清除有直接关系。

核苷酸类似物耐药问题是乙肝治疗中的关键问题之一，近年来，随着核苷酸类似物等药物的广泛应用，该类药物的耐药菌显著增多。有研究资料指出，在乙型肝炎的治疗中，使用拉米夫定的一年耐药率为24%，五年耐药率为70%，使用阿德福韦酯五年耐药率为29%，使用替比夫定两年耐药率为17%，乙肝病毒的耐药性问题非常严重。耐药性的增加会导致临床疗效丧失，增加临床治疗难度，患者发生肝硬化等严重并发症的几率也会增加[8]。在本文研究中发现，B型与C型均会出现耐药性，C基因型发生拉米夫定耐药性37.6%、替比夫定耐药性37.6%，显著高于B基因型的耐药性，这与C基因型感染预后差有直接关系。临床上，拉夫米定是治疗乙肝病毒的常用药物，其抗病毒机制明确、临床应用广泛，随着该类药物的普遍应用，拉夫米定耐药性问题凸显，诱发乙型肝炎病毒基因变异是导致拉夫米定耐药的主要机理，一旦突变毒株成为优势菌株后，其抗病毒效果会大打折扣，甚至毫无效果，严重的还会导致乙型肝炎病毒活跃、患者病情加重。本次研究还发现，rt180M突变、rt204V突变、rt204I突变发生几率最高，故而在使用核苷酸类似物治疗的过程中，必须及时开展基因耐药突变检测，更好地帮助医生判断病情、合理选择药物，这对改善患者预后有重要作用。

综上所述，东莞地区乙肝病毒基因分型以B型和C型为主，rt180M突变、rt204V突变、rt204I突变发生几率最高，C型耐药性更强，对此应根据病毒基因分型选择治疗药物，不断改善患者预后。