大菜粉蝶幼虫头部化学感器的超微结构及其对坡柳皂苷的味觉感受

马驰宇，李丰超，于 航，刘全俊，秦小萍*

(1.云南农业大学 植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学 水利学院，云南 昆明 650201)

感受器作为昆虫联系外界环境的媒介，一直以来是昆虫学家研究的重点[1,2]，其中头部感受器研究更为频繁。感受器是体壁一个特化的区域，其在昆虫栖息地定位、寄主识别、取食、觅偶、交配、产卵以及躲避天敌等方面发挥着重要作用[3,4]，是昆虫信息探测和接收的‘雷达’装置，具有灵敏度高、功能专一等特点[5,6]。昆虫感受器在异种昆虫间形态功能差异显著，在同种昆虫间也不尽相同[7-9]。作为取食中心和感受器最集中的头部，目前主要以成虫触角为研究对象[10-13]，有关幼虫感受器的研究较少，已报道的有小菜蛾[14,15]、甜菜夜蛾[2]、端黑萤[16]、豇豆荚螟[17]、苹果蠹蛾[18]、黄野螟[19]、筛胸梳爪叩甲[20]、亚洲玉米螟[21]、麻楝蛀斑螟等[22]、金银花尺蠖[4]、山茱萸蛀果蛾[23]、双委夜蛾[24]、棉铃虫[25]、朱红毛斑蛾[26]、绿翅绢野螟[27]、小地老虎[28]、灰茶尺蠖[29]。所以，开展幼虫头部化学感受器的研究，对于了解幼虫的食性机理，探究昆虫的取食行为本质及病虫害防治具有重要的参考价意义。

大菜粉蝶Pierisbrassicae属鳞翅目(Lepidoptera)粉蝶科(Pieridae)，是白粉蝶属下的一种蝴蝶，又名欧洲粉蝶、甘蓝粉蝶、大白蝶，其幼虫俗称甘蓝毛虫，寄主为油菜、白菜、萝卜和甘蓝等十字花科植物，其为害特点为小龄幼虫群集于叶背啃食叶肉，龄期大后则分散成小群暴食叶片，甚至连叶脉和叶柄都吃光，严重影响油菜和蔬菜的质量和产量[30]。目前，一些研究者对粉蝶科的部分昆虫感受器的形态结构和功能进行了研究[5,8,23,24]。基于本课题组前期对坡柳的研究[31,32]，本文进一步报道大菜粉蝶幼虫下颚瘤状体感受器在受坡柳皂苷刺激后所引起的电生理反应的特征，以期进一步探明大菜粉蝶幼虫感器结构与功能之间的关系。

1 材料与方法

1.1 材料

大菜粉蝶(PierisbrassicaeL.)幼虫于2018年8月采自昆明市富民县海拔2000 m以上的野生白菜型油菜上，在云南农业大学大棚内进行室内饲养。试验以刚蜕皮的5龄幼虫为试验材料。

药品及试剂：实验室制备坡柳皂苷；氯化钾购于天津市北辰方正试剂厂；戊二醛(2.5%)、PBS缓冲液(pH 7.2)、国产分析乙醇。仪器：解剖镜(OLYMPUS SZ51)、物镜(DPTOPWF20X/12)、扫描电子显微镜(日立S-3000N)、镀膜仪(E-1010)。利用顶端记录仪(Tip Recording) 测定幼虫的味觉电生理反应。微动操作仪(MP-22Syntech，荷兰)。

A：头部背面观(Bar=1 mm)(×45)；B：头部侧面观 (Bar=1 mm)(×90)；C/D：头部腹面观(Bar=1 mm)(×50)：A：触角；C：头冠缝；CL：唇基；FS：额缝；F：额；Fsu：额唇基沟；Lar：上唇；Lai：下唇；LP：下唇须；Mn：上颚；MP：下颚须；Mx：下颚；O(1～6)：单复眼；Spi：吐丝器；ST：刚毛。
图1 大菜粉蝶幼虫头部的扫描电镜照片

1.2 样品制备

将选取的幼虫置于垫有滤纸的培养皿中，于-4 ℃冷冻5～10 min，致其冻僵昏迷，在解剖镜下，迅速从第一胸节和第二胸节之间切下头部，用滤纸吸净幼虫头部的淋巴液，以防止污染。

制备程序：取样→固定→清洗→梯度脱水→干燥→喷金。将昆虫头部浸入4 ℃预冷的2.5%的戊二醛中包埋24 h以上；取出后用pH 7.2的磷酸缓冲液反复洗涤3次，每次10 min，第一次超声3 min，后用1%饿酸固定1～2 h；取出后用pH 7.2的磷酸缓冲液洗涤3次，每次10 min，然后经30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇梯度脱水各一次，每次15～20 min，无水乙醇脱水2次；在室温下自然风干后，用叔丁醛包埋2次，每次0.5 h，接下来在-20 ℃下干燥2 h，将干燥好的样品头部腹面朝上粘于有导电胶的样品台上。置于E-1010(HITACHI Co.，Ltd)真空镀膜仪进行离子溅射喷金。用日立S-3000N(HITACHI Co.，Ltd)扫描电镜观察。

1.3 数据处理

电镜照片用Adobe Photoshop CS5 软件标注感受器的名称，用ImageJ 1.48 软件测量各类感受器的长度与宽度；试验数据采用Excel进行统计。电位信号数据用Autospike 3.7(Syntech，荷兰)进行分析，记录电位的种类和脉冲频率。

2 结果与分析

2.1 头部特征

扫描结果显示，大菜粉蝶幼虫头部近似椭圆形，头长约2.75 mm，宽约2.22 mm，口器为下口式，头背面蜕裂线呈倒“Y”字形，由头冠缝和额缝组成；额呈三角状，左右对称，两侧分布着大量的毛形感受器(如图1A)；侧单眼分布在头部两侧，侧单眼与上颚之间着生着一对长三节的触角；触角所在的头部腹面分布着上唇、上颚、内唇、下颚以及下唇等，上唇分布于头部中央，唇后方分布着唇基，额唇基沟十分清晰(图1C)，上唇对称分布着6对长短不一的毛状感器，2对在上颚，位于缺刻的上方。

A：触角分为3节及第二节上的毛形感器(St)和刺形感器(Sc)(Bar=200 μm)(×180)；B：触角梗节上的感受器：锥形感受器(Sb)、毛形感器(ST)、刺形感器(Sc)(Bar=200 μm)(×350)；C：触角鞭节上的感受器：锥形感受器(Sb)和栓锥感受器(Ss)(Bar=50 μm)(×700)。
图2 大菜粉蝶幼虫触角扫描电镜照片

2.1.1 触角 大菜粉蝶幼虫的触角分3节，由柄节、梗节、鞭节组成，约为593.73 μm长、171.97 μm宽(图2A)。扫描电镜观察到大菜粉蝶触角上有4类感受器，分别为毛形感器(sensilla trichodea，St)、刺形感器(sensilla chaetica，Sc)、锥形感器(sensillabasiconica，Sb)以及栓锥感器(sensilla styloconicum，Ss)。有一根较长毛形感器，长约454.70 μm，一根较短的刺形感器，约159.33 μm长，着生在第二节梗节上(图2B)，另外还着生有两个较大的锥形感受器和1个较小的锥形感受器，长度分别约为23.30、14.19、6.79 μm(图2B)。第三节鞭节上的感受器包括一个栓锥感受器，长约24.94 μm，3个锥形感受器,长度约为19.55、8.38、6.55 μm，其中一个稍大，其余两个较小(图2C)。2.1.2 口器化学感受器 口器化学感受器是由下唇、下颚和舌组成的一个结合体(图3A)。下颚位于外侧，舌和下唇位于内侧，下颚由下颚须和下颚瘤状体组成。

2.1.2.1 下颚须 大菜粉蝶幼虫在靠近口腔的部位着生有下颚须(图3A)，下颚须由3节组成，长约196.56 μm，宽约115.36 μm(图3B)，在第三节端部着生有8个锥形感受器(图2C)，长分别为6.68、6.61、6.03、5.38、5.02、4.86、4.30、4.10 μm，排列为3-1-3-1的模式(图3C)；另外，下颚须基部靠近内侧分别着生有一根长约183.65 μm的刺形感受器(Sc)，一根长约259.59 μm的毛形感受器(St)。

A：口器附肢：下颚须、下颚须瘤状体(bar=300 μm)(×150)；B：下颚须三节(100 μm)(×400)；C：下颚须端部8个锥形感受器(bar=20 μm)(×2000)；D：下颚须瘤状体中栓锥感受器(Mss)、侧栓锥感受器(Less)以及侧边两个锥形感受器(Sb)(bar=50 μm)(×900)；E：中栓锥感受器(Mss)、侧栓锥感受器(Less)端部形态(bar=30 μm)(×1500)；F：下颚须瘤状体基部毛状感受器(Sc)(bar=100 μm)(×400)。
图3 大菜粉蝶幼虫口器附肢扫描电镜照片

2.1.2.2 侧栓锥、中栓锥 下颚须瘤状体如图3A所示，其上主要着生有栓锥感受器(Ss)，锥形感受器(Sb)和刺形感受器(Sc)3种类型的感受器，其中，靠近舌的两个较大的栓锥感器对幼虫的食物选择及取食调节起着重要作用，是昆虫学家研究的重点，内侧的是中栓锥感受器(medial styloconic sensilla, Mss)，外侧的是侧栓锥感受器(lateral styloconic sensilla, Less)，如图3D所示，长宽分别为58.31、32.75 μm和42.28、36.90 μm；另外在中栓锥感器(Mss)和侧栓锥感器(Less)旁还有两个锥形感受器(Sb)，长度约为16.16、6.70 μm，一个较小的栓锥感受器(Ss)，长17.02 μm，以及外侧3根等距离排列的刺状感受器(Sc)(图3F)。在侧栓锥和中栓锥感受器顶端可见分叉的两个凸起，一个光滑，一个粗糙，粗糙凸起表面存在微孔(图3E)，推测可能是栓锥感受器(Ss)进行信息交流的通道。

2.1.2.3 下唇 下唇在下颚下侧，由一对下唇须(Lower lip whiskers)及一个吐丝器(Spinner)组成(Bar=100 μm)，长度分别约为162.70 μm和108.76 μm，如图4所示。下唇须上着生有一个锥形感受器和一个栓锥感受器，长约120.69、57.22 μm。下唇须的主要功能是协助下颚感触和托挡食物，也具有一定的味觉功能，帮助寄主选择食物。下唇中央的小管状构造为吐丝器，吐丝器的主要功能是通过吐丝固定身体，以便蜕皮和化蛹，在吐丝器两侧有多对刺形感受器。

图4 大菜粉蝶幼虫口器下唇须(Bar=100 μm)(×450)

2.2 拒食物质对下颚栓锥感受器的作用

坡柳皂苷均能诱发下颚瘤状体感受器中栓锥感受器和侧栓锥感受器产生电生理信号，且单位时间内侧栓锥感受器的电位数低于中栓锥感受器；同时KCl溶液刺激下颚瘤状体栓锥感受器亦能引起脉冲频率，中栓锥感受器高于侧栓锥感受器和对照，侧栓锥感受器与对照之间差异不明显(图5)。

A：大菜粉蝶幼虫侧栓锥感受器对1 mg/mL坡柳皂苷的电生理反应；B：大菜粉蝶幼虫中栓锥感受器对1 mg/mL坡柳皂苷的电生理反应；C：大菜粉蝶幼虫侧栓锥感受器对2 mmol/L KCl溶液的电生理反应；D：大菜粉蝶幼虫中栓锥感受器对2 mmol/L KCl溶液的电生理反应。
图5 大菜粉蝶幼虫对坡柳皂苷的电生理反应

3 讨论

昆虫化学感器影响昆虫的行为活动，包括取食、产卵、择偶、回避等，因此，研究昆虫感器对于揭示昆虫取食机制、行为及生理学具有十分重要的意义。通过扫描电镜对大菜粉蝶幼虫头部感器特征进行了观察。结果显示：大菜粉蝶幼虫头部分布着4种感器，分别是毛形感器、刺形感器、栓锥感器和锥形感器。触角上主要有 6个锥形感器、1个栓锥感器、1个毛形感器和1个刺形感器，外形上与多数鳞翅目幼虫感器相似，与其他鳞翅目幼虫[14,17-22,26-29,31]相比数量更多。大菜粉蝶幼虫的单眼数量与金银花尺蠖、豌豆荚螟、苹果蠹蛾、小地老虎、朱红毛斑蛾、灰茶尺蠖、草地贪夜蛾幼虫相同[4,17,18,26-29,32]，都为6个，与5个单眼的麻楝蛀斑螟、黄野螟幼虫不同[19,22]。8个锥形感受器以3-1-3-1序列排列在口器附肢下颚须端部,基部着生着1个毛形感器和1个刺形感器。有研究发现下颚须上的锥形感器具有嗅觉和味觉的作用[29]。下颚须瘤状体上感器主要为栓锥感器、锥形感器、刺形感器，数量分别为3个、2个和3个，其中，较大的两个栓锥感器中栓锥、侧栓锥感器一直以来是昆虫学家研究鳞翅目昆虫取食机理的重点[33-38]。本研究发现，中栓锥感器和侧栓锥感器顶端是一个分叉的2个凸起，一个表面光滑，一个表面粗糙，与前人的研究结果“是一个凸起”不一致[21,25]；下唇须上着生1个锥形感受器和1个栓锥感器，吐丝器较下唇须长，端部可见吐丝孔。由于环境适应性的差异，不同种昆虫甚至同种昆虫间存在感受器上的结构差异，这决定了昆虫在自然界的强大的生存能力。

电生理研究表明，坡柳皂苷均能诱导中栓锥和侧栓锥感器产生电生理反应，说明大菜粉蝶中栓锥和侧栓锥感器中存在坡柳皂苷的抑制素细胞或者坡柳皂苷能刺激其他细胞产生反应，从而表现出对食物的厌食反应，推测可能与感受器上存在的抑制素细胞有关。前人的研究主要集中在体积较大的下颚瘤状体上的4个栓锥感受器上，已有的研究发现，每个感觉器具有5个感觉细胞，在5个细胞中有4个味觉感觉细胞、1个机械细胞；Schoonhoven等[38]根据感觉细胞的感觉谱将能感觉寄主植物次生物质信息的感觉细胞称为信号刺激感觉细胞，感觉初生物质的感觉细胞称为糖和氨基酸感觉细胞或忌避细胞，如位于大菜粉蝶中栓锥感器上的信号感觉细胞主要是对十字花科蔬菜的芥子油苷类物质高度敏感，蓼二醛能对大菜粉蝶幼虫下颚外颚叶上的中央栓锥感器内的取食抑制素感受细胞起激发作用。坡柳皂苷作为植物次生物质，其对大菜粉蝶幼虫取食的抑制机理尚不够清楚，有待进一步的深入研究。