贝莱斯芽孢杆菌CY30菌株的常压室温等离子体诱变育种研究

刘芳 廖先清 周荣华

摘要：采用常压室温等离子体诱变贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）CY30菌株。菌株的致死率强度结果表明，在电源功率为100 W，处理距离2 mm，工作气流量10 L/min时，等离子体对CY30菌株诱变最优处理时间为50 s。通过显微镜检初筛诱变菌株，并利用摇瓶发酵结合芽孢数测定和杀菌活性评价进行复筛，建立完整的诱变筛选体系。通过斜面镜检初筛、摇瓶三轮复筛，获得摇瓶液芽孢数122.3亿/mL，杀菌活性75.58%，且遗传稳定的突变菌株CY30-314。突变株发酵水平较出发菌株芽孢数提高25.3%，杀菌活性提高15.6%，发酵周期缩短了2 h。

关键词：常压室温等离子（ARTP）;贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;芽孢数;杀菌活性

中图分类号：TQ920.1         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）10-0077-04

Abstract： Atmospheric and room temperature plasma（ARTP） was used to mutate Bacillus velezensis CY30 for improving the production of spores and fungicidal activity. The most optimal condition for the ARTP mutagenesis was working flow rate at 10 L/min， treating distance of 2 mm and electrical power of 100 W . The mutants were selected based on microscopic morphology of the colonies， the spore counts and antifungal activity of the cultures from shake-flask fermentation. A mutant with code of CY30-314 was obtained through 3 rounds of microscopic checking of the slants and shake-flask fermentation. The spore counts of the mutant in shake-flask fermentation was 12.23 billion spores/mL， and the corresponding cultures inhibited the growth of fungus for 75.58%. The mutant also showed genetic stability. The mutant produced 25.3% more spores in shake-flask fermentation which resulted in the increase of antifungal activity at 15.6%. The duration of the mutant was shorted for 2 h.

Key words： Atmospheric and room temperature plasma（ARTP）; Bacillus velezensis; spore count; antifungal activity

貝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）最早由Ruiz-Garcia等[1]从采自西班牙贝莱斯河的水样中分离，可产生表面活性剂。有研究表明，不同环境中分离到的贝莱斯芽孢杆菌具有较为广谱的抗菌活性，可抑制多种植物病原真菌、部分植物病原细菌，如抑制黄单胞菌及马铃薯疮痂病菌等生长[2，3]。前期研究表明，从茶树根际土壤中分离到贝莱斯芽孢杆菌CY30菌株，其对多种植物病原真菌具有较强的抑菌活性，并对茶轮斑病具有一定的防效[4]。

为了推动CY30菌株的产业化，对该菌株的发酵培养基进行优化，发现该菌株在发酵过程中芽孢形成不整齐，不同批次的发酵差异大。为了满足后续工业化生产的需要， 有必要对野生菌株进行菌种选育。常压室温等离子体（Atmospheric and room temperature plasma， ARTP）技术是新兴的一种诱变技术，因其具有基因损伤强度高、突变范围广、处理条件温和、安全无辐射、操作便捷等优点[5]，被广泛应用于不同微生物的诱变。廖先清等[6]利用该菌株进行了苏云金芽孢杆菌的诱变育种，取得了较好的效果。本研究中，利用常压室温等离子体诱变技术对CY30菌株进行诱变育种，探索最佳诱变条件，以期获得最佳突变株，提高该菌的产孢水平及抗菌活性，缩短发酵周期。现将试验结果报道如下。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌株  贝莱斯芽孢杆菌CY30菌株由湖北省生物农药工程研究中心从湖北恩施鹤峰县茶园根际土壤分离得到，并保存于武汉大学中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M2018710。

1.1.2  供试病原菌  茶拟盘多毛孢（Pestalotiopsis spp.）病原真菌由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。

1.1.3  培养基  ①PDA培养基：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加无菌水煮沸30 min，纱布过滤，定容1 L，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，煮沸，121 ℃灭菌20 min;②LB斜面培养基：胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母提取物5 g，琼脂粉20 g，无菌水1 L，pH 7.0;③LB液体培养基：胰蛋白胨10 g，氯化钠5 g，酵母提取物5 g，无菌水1 L，pH 7.0，500 mL三角瓶装液量为100 mL;④发酵培养基：红薯粉37.35 g，花生粕15.00 g，酵母膏15.29 g，工业蛋白胨15.00 g，碳酸钙1.00 g，硫酸镁0.30 g，磷酸二氢钾0.10 g，无菌水1 L，灭菌前pH调至7.5，500 mL三角瓶装液量为50 mL。

1.1.4  试剂与仪器  常压室温等离子体诱变机，无锡源清天木生物科技有限公司;恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司;摇床，上海智城分析仪器制造有限公司;721可见分光光度计，上海仪电科学仪器股份有限公司;超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司;显微镜，奧林巴斯。

1.2  菌株的ARTP诱变

1.2.1  芽孢悬浮液的制备  将保藏于砂土管的贝莱斯芽孢杆菌CY30菌种直接转接于LB茄形瓶斜面培养基上进行复壮，置于30 ℃恒温培养箱中培养96 h，挑一环菌苔转接于LB液体培养基中，220 r/min，30 ℃振荡培养至芽孢全部形成。无菌水稀释至一定浓度，分光光度计测定OD600 nm在0.3～0.5，作为诱变母液。

1.2.2  菌株的ARTP诱变  在超净工作台中用移液枪移取10 μL芽孢悬浮液，均匀涂抹在直径为6 mm的无菌金属垫片上，将其置于无菌平皿内并移至预热20 min的ARTP诱变机中，电源功率为100 W，处理距离2 mm，工作气流量10 L/min，以氦气为工作气体，以处理时间为诱变的主要操作参数，诱变时间设置为20、40、60、80、100、120 s。诱变处理完成后取出金属垫片，放入装有1 mL无菌水的EP管中，涡旋振荡1 min。取经振荡的菌液稀释至适当浓度涂平板，放入30 ℃恒温培养箱中培养48 h 。经上述条件培养后，计数各平板上单菌落个数，取3次平均值，绘制出致死率曲线。

1.2.3  ARTP诱变致死率的计算  致死率=（A-B）/A×100%，其中，A为诱变处理前芽孢液的浓度;B为诱变处理后芽孢液的浓度。

1.3  诱变菌株的筛选

整体筛选流程如下：

单菌落转接试管斜面→涂片镜检→摇瓶发酵→涂片镜检→摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价→制砂管保存→转接斜面→涂片镜检→摇瓶复筛→摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价→传代保种。

1.3.1  斜面镜检初筛  将经ARTP诱变处理后在LB平板上长势均一的单菌落用接种环挑起接种在LB试管斜面上，于30 ℃恒温培养96 h，划线涂片，进行显微镜检。

1.3.2  摇瓶筛选  将斜面镜检芽孢形成率高、营养体少的菌株接种一环于发酵培养基中，30 ℃ 220 r/min振荡培养，涂片镜检，芽孢脱落20%下摇床。

1.3.3  摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价  挑摇瓶发酵镜检芽孢形成率高于90%、菌体整齐、生长速度快的进行发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价。

1.3.4  砂土管保存  挑取摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价均高于出发菌株10%以上的菌株，刮下芽孢放入已灭菌并经无菌检查的砂土管中，用接种环打散混匀，置于干燥器中保存。

1.4  摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价

1.4.1  芽孢数测定  采用稀释涂布平板计数法测定，稀释液涂布LB平板前置于80 ℃水浴20 min。

1.4.2  抑菌活性测定

1）拮抗菌发酵液。接种一环菌苔于发酵培养基中，30 ℃ 220 r/min振荡培养至芽孢脱落20%时下摇床。

2）无菌滤液。取发酵液，4  ℃10 000 r/min离心10 min，弃沉淀，得上清液后用0.22 μm微孔滤膜过滤3次得无菌滤液。

3）病原菌菌饼。将茶拟盘多毛孢接种到PDA平板上，25 ℃恒温培养，当菌丝覆盖培养皿1/4至1/3时，用打孔器打孔4 mm菌饼待用。

4）抑菌活性的测定。4 mm菌饼背面朝上置于PDA平板中央，在菌饼两侧约30 mm处放置灭菌滤纸片，在纸片上接种7 μL无菌滤液，以不接CY30作为对照，试验共设置3次重复。28 ℃培养5 d测量对照和处理的菌落直径并计算抑菌率。

抑菌率=（对照菌落直径-处理菌落直径）/对照菌落直径×100%

1.5  突变株遗传稳定性分析

在斜面培养基上活化筛选得到高活性菌株，培养96 h，连续在斜面上转接5次，进行摇瓶发酵，分别进行显微镜检芽孢形成率、发酵液芽孢数测定、杀菌活性测定，比较突变株的稳定性。

2  结果与分析

2.1  ARTP诱变时间的选择

ARTP不同诱变时间下贝莱斯芽孢杆菌CY30菌株的致死率曲线如图1所示。从图1可以看出，随着诱变时间的增加，菌体的存活率逐渐降低。40 s后致死率大幅度上升，这说明贝莱斯芽孢杆菌CY30菌株对ARTP较敏感，产生的致突变能力较大，处理60 s后致死率已经大于90%，当处理时间为100和120 s时，致死率接近100%。

2.2  高产突变株的筛选

2.2.1  斜面初筛  将ARTP诱变50 s并经5次单菌落分离得到的1 214株斜面菌株进行涂片镜检，斜面镜检孢囊形成率高、营养体少、菌体整齐的菌株，共得到118株优势菌株进行下一轮摇瓶发酵。5次镜检初筛优势菌株比例在10%左右，镜检情况如表1所示。

2.2.2  摇瓶筛选  将斜面镜检初筛得到的118株优势菌株进行摇瓶发酵，并以出发菌株作为对照。得到18株发酵芽孢形成率高于95%、菌体整齐、形态好的突变株，分别进行摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价，3次重复取平均值。结果如表2所示，采用芽孢数测定和杀菌活性评价双指标进行高活性突变菌株的判定，均高于出发菌株10%的菌株有8株，分别是CY30-301、CY30-304、CY30-306、CY30-309、CY30-311、CY30-314、CY30-316、CY30-318。

2.3  高活性突变株的摇瓶复筛

将摇瓶筛选得到的8株高活性突变株重新进行摇瓶发酵，并以出发菌株作为对照。进行显微镜检，芽孢脱落20%停止培养，进行摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价，3次重复取平均值。由表3可知，CY30-314综合摇瓶发酵芽孢形成率、发酵周期、芽孢数和杀菌活性等各种指标整体优于其他菌株，发酵水平较出发菌株而言，芽孢数提高25.3%，杀菌活性提高15.6%，发酵周期缩短2 h。

2.4  高活性突变株的遗传稳定性

为了检测突变株的遗传稳定性，对高产突变株CY30-314在试管斜面上连续转接5代，进行显微镜检，摇瓶发酵培养，并进行摇瓶发酵液芽孢数测定和杀菌活性评价，3次重复取平均值，结果（表4）表明，随传代次数的增加，菌株的生物活性等各项性能无明显变化，直至经5次传代后也较为稳定。ARTP诱变产生的突变株CY30-314具有良好的遗传稳定性，可作为工业生产菌株。

3  讨论

分离于自然界的野生芽孢杆菌多存在发酵不稳定、产孢不整齐等特性，其工业化生产必然要对野生型菌株进行选育。菌种选育涉及自然随机筛选与诱变筛选。采用自然随机筛选时，由于自然突变率极低，正突变的频率更低，通常研究者较少采用，多用于菌种的复壮或纯化。而诱变筛选中，应用较为广泛的包括紫外线辐照（UV）、亚硝基胍（NTG）、Co60γ射线辐照或物理化学诱变的结合[7]，但这些诱变方法都存在这样或那样的缺点。ARTP诱变育种技术操作简便，并被应用于多种微生物的育种。本研究中，利用ARTP对CY30进行诱变育种，达到了预期的目的，证明了所建立的诱变筛选体系是高效、可行的。该方法也为其他芽孢杆菌的菌种选育提供了借鉴。本研究除提高了贝莱斯芽孢杆菌的发酵水平及抑菌活性外，还缩短了该菌株的发酵周期，可望在工业化大规模生产中显著降低生产成本。

参考文献：

[1] RUIZ-GARCIA C，B？魪JAR V，MATINEZ-CHECA F，et al. Bacillus velezensis sp. nov.，a surfactant-producing bacterium isolated from the river Velez in Malaga，southern Spain[J].Intl J Syst Evol Microbiol，2005，55：191-195.

[2] 张彩文，程  坤，张  欣，等.贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）分類学及功能研究进展[J].食品与发酵工业，2019（17）：258-265.

[3] 李生樟，陈  颖，杨瑞环，等.一株拮抗黄单胞菌的贝莱斯芽孢杆菌的分离和鉴定[J].微生物学报，2019，59（10）：1969-1983.

[4] 刘  芳，廖先清，周荣华，等.响应面法优化贝莱斯芽孢杆菌CY30发酵培养基的研究[J].湖北农业科学，2019，58（23）：91-94.

[5] 张  雪，张晓菲，王立言，等.常压室温等离子体生物诱变育种及其应用研究进展[J].化工学报，2014，65（7）：2676-2684.

[6] 廖先清，周荣华，刘  芳，等.常压室温等离子体（ARTP）诱变快速选育对亚洲玉米螟高毒的苏云金芽孢杆菌突变株[J].湖北农业科学，2018，57（21）：123-126.

[7] 李荣杰.微生物诱变育种方法研究进展[J].河北农业科学，2009， 13（10）：73-76，78.