牡丹废弃物用于制备发酵可利用还原糖的研究

王军华，张翔，王易芬，张彦昊，辛雪，陈蕾蕾，赵双枝

（山东省农业科学院农产品研究所／山东省农产品精深加工技术重点实验室／农业农村部新食品资源加工重点实验室，山东 济南 250100）

牡丹是我国特有的木本花卉和药用植物，自2011年中国政府批准牡丹籽油作为一种新的食品资源以来，每年都有大量的牡丹籽被采集作为生产油脂的原料［1，2］。但在采收牡丹种子的同时，往往会有枝、叶、果荚等掺杂其中，通常在晾晒后再进行分离去除，因此牡丹籽油生产中会产生大量的废弃物，这些废弃物或者被作为低值柴薪，或者被大量丢弃影响生态环境［3，4］。

目前关于牡丹废弃物的研究较少，主要集中于牡丹果荚中有效成分的提取，如抗氧化活性物质［5］、白藜芦醇［6］、黄酮类化合物［1］以及多糖［3，4］等，而对其中丰富的纤维素鲜少关注。前期研究发现，牡丹的叶、果荚、枝中纤维素、半纤维素和木质素含量在44%～72%之间，含量较高［7］。有研究证明，一些木质素、纤维素、半纤维素含量高的生物材料如杂交杨木、柳枝稷、玉米淀粉、餐厨垃圾等，可经处理后制备发酵可利用还原糖，再经生物转化制备高附加值产品，如生物燃料、可降解生物塑料等［8-10］。因此，本研究对牡丹籽油生产中废弃物的木质纤维素组成和制备发酵可利用还原糖的方法和产量进行研究，以期开拓牡丹废弃物的新功能，开辟新的应用途径，同时解决其弃置带来的环境污染和资源浪费问题，从而完善牡丹产业链条，为促进牡丹产业的发展起到积极作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

牡丹（Paeonia ostii）枝、果荚、叶均采自山东菏泽牡丹示范基地，晾干后分开收集，经微型植物试样粉碎机（FZ102，北京市永光明医疗仪器厂）粉碎后过60～80目筛，自封袋分别分装，阴凉干燥处保存。纤维素酶（Aspergillus niger，1.4 U／mg），购于Sigma-Aldrich；其他化学试剂为市售分析纯试剂。

1.2 牡丹废弃物中木质纤维素组分分析

1.2.1 木质纤维素含量分析 将粉碎后的牡丹枝、果荚、叶样品，在（105±2）℃下干燥至恒重后测定其木质纤维素含量。酸性洗涤纤维（ADF）测定参照NYT 1459—2007；中性洗涤纤维（NDF）测定参照GB／T 20806—2006；酸性洗涤木质素（ADL）测定参照GB／T 20805—2006。

根据以下公式计算样品中的木质纤维素含量［11］：

半纤维素（%）＝NDF（%）-ADF（%） ；纤维素＝ADF（%）-经72%硫酸处理后的残渣（%） ；

ADL（%）＝经72%硫酸处理后的残渣（%）-灰化后的灰分（硅酸盐，%） 。

1.2.2 傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析 取0.1 g样品，经KBr压片，使用Bruker vertex 70（德国布鲁克公司）近红外光谱分析仪，扫描范围4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，每个样品扫描32次。

1.3 牡丹废弃物预处理及其效果分析

1.3.1 原材料的预处理 设置微波-碱法和水浴-碱法两种方法对原材料进行预处理，以筛选还原糖产量高的预处理方法。取3.0 g样品，加入2%（m／v）的NaOH溶液30 mL，室温放置溶胀1 h，然后分别采用微波和水浴加热处理1 h：①以896 MHz、20 kW 的微波源进行加热预处理（由上海海洋大学食品学院食品热加工工程技术研究中心提供设备和技术支持），温度（90±3）℃；②水浴加热，温度（90±1）℃。

预处理结束后用布氏漏斗趁热过滤，上清液留待GC-MS分析；滤渣用热水清洗至中性，通风干燥至少72 h，再粉碎过60～80目筛使样品均匀，以备FTIR分析和还原糖制备。

1.3.2 原材料预处理效果的GC-MS和FTIR分析 （1）气相色谱-质谱（GC-MS）分析：利用7890气相色谱仪串联5977四级杆质谱仪（美国Agilent公司），选用HP-5MS弹性毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25μm）对预处理样品的上清液进行成分分析。初始温度40℃，保持4 min，然后以3℃／min的速度上升至250℃，保持20 min；进样口250℃，分流比30∶1；载气（He）流速1.0 mL／min。电子电离源，轰击能量70 eV，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，全扫描模式，m／z 35～350。

（2）FTIR分析：取0.1 g预处理后的样品，参考1.2.2所述方法进行FTIR分析。

1.3.3 还原糖制备及含量测定 采用纤维素酶解法制备还原糖：称取0.2 g预处理后的样品，加入10 mL柠檬酸钠缓冲溶液（50 mmol／L，pH 4.8），加入200 U纤维素酶，使酶的终浓度达到1 000 U／g，在50℃、180 r／min条件下酶解36 h。反应结束后，沸水浴10 min灭活纤维素酶，10 000 r／min离心2 min，取上清用于还原糖含量测定。

参考文献［12］的方法，以葡萄糖为对照，采用3，5-二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖含量。标准曲线绘制：配制5.20 mg／mL的葡萄糖标准溶液，分别吸取0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100μL的标准溶液于5 mL离心管中，分别加入100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、0μL双蒸水，然后加入150μL DNS试剂，煮沸5 min，冷却后加1 750μL双蒸水至总体积2 mL，测定540 nm处吸光度值OD540。以不加葡萄糖的处理组为空白对照，扣除本底，以葡萄糖浓度（mg／mL）为横坐标、OD540为纵坐标制作标准曲线。

取酶解反应后的上清液，稀释至适当浓度，加入150μL DNS试剂，按照上述方法测定OD540，扣除本底，根据标准曲线计算出酶解后的还原糖浓度CR。

CR＝C0×n，其中C0为根据标准曲线得出的还原糖浓度，n为稀释倍数。

1.4 数据处理

数据利用Microsoft Excel 2010软件进行统计，利用SPSS 22.0软件采用Duncan’s法进行0.05水平的显著性分析。方差分析结果均以平均值±标准偏差表示。

2 结果与分析

2.1 牡丹不同部位废弃物中木质纤维素组成分析

牡丹枝中的木质纤维素（木质素、半纤维素、纤维素）含量最高，达72.84%，叶和果荚中的含量相当；枝中的综纤维素（半纤维素、纤维素）含量最高（56.09%），远高于叶（36.19%）和果荚（40.00%）（表1）。

表1 牡丹不同部位废弃物中的木质纤维素组成 （%）

对木质材料的近红外光谱研究显示，所有木材样本均会出现以下吸收峰：在3 400 cm-1附近和2 900 cm-1附近出现显著的峰型，在1 750～1 000 cm-1的广泛吸收范围内涵盖许多离散峰［13］。本研究对牡丹叶、果荚、枝三个部位的FTIR分析结果也显示，在上述相应位置同样出现这些主要特征峰，仅有部分收缩振动峰的位置和峰型存在差异（表2）。

在1 512～1 515 cm-1和1 238～1 245 cm-1的峰位是表征木质素的主要吸收峰，其中，1 238～1 245 cm-1附近的峰是表征木质素中愈创木基的特征峰；1 512～1 515 cm-1峰位的吸收峰是木质素芳香环碳骨架振动产生的，有研究显示吸收峰位置高于1 509 cm-1的木质素以愈创木基为主［14］，表明，牡丹中主要为愈创木基木质素。牡丹枝中这两个特征峰的强度更为显著（图1），表明牡丹枝中的木质素含量更高，这与含量测定结果一致。

表2 牡丹不同部位的红外光谱吸收峰归属

1 319～1 334 cm-1峰位的特征峰和1 106～1 108 cm-1峰位的吸收峰是木质素中紫丁香基结构单元的特征表达，从牡丹枝和果荚的红外图谱中检出了这两个峰，表明牡丹枝和果荚中也含有一定量的紫丁香基木质素。

另外，牡丹不同部位在1 726～1 736 cm-1峰位的吸收峰在位置和强度上存在较大差异（图1）。有研究显示，该位置的吸收峰与纤维素和木质素的相对含量有关，两者占比越大，该吸收峰就越向波数低的位置移动［13，15］。由此可以得出牡丹果荚中纤维素和木质素的相对含量最高，其次为叶和枝。这与前述牡丹木质纤维素组成分析结果中的纤维素和木质素含量是枝＞叶＞果荚相反，造成这种现象的原因还需深入研究。

2.2 预处理样品的GC-MS分析

GC-MS分析结果表明，牡丹不同部位经不同预处理方式处理所得上清液中的物质数量和种类有差异。

牡丹叶经两种方法预处理后的上清液检出物质种类差异较大，水浴加热处理检出6种物质，微波加热处理则检出16种物质，都检出苯基乙烯衍生物和草酸衍生物；此外，微波加热处理叶的上清液中还检出酚结构类似物（甲氧基苯丙胺、二甲基苯氧基取代乙胺、氨甲基甲酸苯酯、硝基甲氧基取代苯基乙烯）。而牡丹果荚和枝经两种方法预处理后上清液中检出的化学成分数量相似，但种类不同。水浴-碱法和微波-碱法预处理果荚上清液中分别检出了14种和15种成分，均检出了甲醇、去甲伪麻黄碱、乙酸、1-羟基-2-丙酮、丁内酯、2-羟基桉叶素、D-甘露糖7种成分；在牡丹枝的两种预处理上清液中都检出了12种成分，均包括甲醇、草酸乙烯酯、2-呋喃甲醇、苯丙胺和苯基乙烯衍生物5种成分。

2.3 预处理样品的FTIR分析

FTIR分析结果（图2）显示，微波-碱法和水浴-碱法处理后的牡丹三个部位样品的光谱形状和出峰位置基本相似，表明这两种预处理方式对不同原材料的处理效果没有显著差异；而与未经预处理的原料相比，在1 726～1 736 cm-1以及1 238～1 245 cm-1附近的木质素特征吸收峰，强度显著减弱，证明碱预处理确实可有效移除木质素；同时，1 512 cm-1的吸收峰峰型未发生显著变化，但从1 512 cm-1位移到1 508 cm-1附近，上述结果均表明愈创木基发生破坏。此外，牡丹果荚和枝的光谱图中，1 319～1 320 cm-1处的吸收峰未发生变化，表明这些预处理手段可能并不能有效破坏紫丁香基。预处理样品在1 376 cm-1左右的峰，芳香环骨架振动和C-H键平面内拉伸的峰值减弱，表明预处理对半纤维素的化学键也造成了损伤；3 400、2 900 cm-1以及1 420 cm-1附近的吸收峰与纤维素的O-H拉伸、C-H拉伸和芳香环骨架伸缩振动有关，峰强度未发生明显变化，这意味着碱预处理未破坏纤维素［18］。

2.4 发酵可利用还原糖的产量

本研究结果（图3）显示，葡萄糖浓度在0.52～5.20 mg／mL范围内，OD540（y）与浓度（x）呈线性相关，得标准曲线y＝0.223x＋0.114，R2＝0.988。

根据标准曲线计算出牡丹不同部位（叶、果荚、枝）的还原糖含量。由表3可见，果荚和枝还原糖产量不同预处理间没有显著差异；但微波处理的牡丹叶还原糖产量较水浴处理提高41.30%；两种预处理方式中，果荚还原糖产量较叶和枝提高了46.62%～110.92%。

表3 不同预处理方式的牡丹不同部位废弃物还原糖产量 （mg／mL）

3 讨论与结论

傅里叶变换红外（FTIR）光谱主要用于研究分子结构与红外吸收谱线的关系，也被广泛用于木材结构与化学成分的研究［17］，虽然基团的吸收振动峰位置会因具体化学结构的不同有些许差异，但仍会出现在特定的区域，因此，对红外吸收峰进行归属，对于木质结构的分析和成分的判断有重要意义。本研究结果表明，牡丹叶、果荚和枝中含有丰富的纤维素，综纤维素含量在36.19% ～56.09%之间，牡丹枝中含量最高；FTIR分析显示其木质素为SG型（即紫丁香基和愈创木基木质素），以愈创木基木质素为主，并确证牡丹枝中的木质素含量最为丰富。

碱性溶液被证实可有效去除木质素而不降解碳水化合物［19］，而且较高浓度的NaOH（1.0%、1.5%和2.0%）预处理可有效提高还原糖产量［20］。因此，本研究选择2%的氢氧化钠溶液（m／v）用于有效移除木质素。微波预处理可以缩短反应时间，加快产物形成，降低反应活化能［21，22］。本研究即对比分析了微波-碱法和水浴-碱法对牡丹枝、叶、果荚进行预处理的效果。经FTIR分析，预处理能有效破坏愈创木基、部分半纤维素，而不破坏纤维素，但是两种预处理方式的FTIR峰型没有明显差别，表明两种预处理方式对木质纤维素的破坏作用差异不明显。对小麦秸秆的研究发现，半纤维素分解可产生羧酸衍生物，木质素降解则产生单酚类衍生物［23］。本研究中GC-MS在预处理叶的上清液中检出这两种成分，与FTIR分析结果一致，表明木质素和半纤维素被破坏，尤其是微波-碱法预处理上清中检出酚结构类似物，表明微波-碱法对叶的木质素破坏作用更为明显；同时，还原糖产量分析结果显示，牡丹叶的微波预处理组还原糖产量是水浴预处理组的1.41倍，差异达显著水平；结合GC-MS分析结果，牡丹叶微波-碱法预处理后的上清液中检出16种化合物，远高于水浴-碱法预处理（6种），这可能是因为碱性预处理能有效去除牡丹叶中的可溶性成分，间接提高综纤维素的相对含量，导致其产糖量较水浴-碱法预处理的产糖量更高。

此外，D-甘露糖是半纤维素的单糖组成单元［24］，GC-MS在预处理牡丹果荚的上清液中同时检出乙酸和D-甘露糖，均证明半纤维素被破坏。至于还原糖产量，在牡丹果荚和枝中，不同预处理的还原糖浓度没有显著差异，但果荚的还原糖产量要显著高于叶和枝的。牡丹枝中的综纤维素含量最高，但还原糖产量却不及果荚。有研究表明，木质素填充于纤维素和半纤维素之间，阻碍纤维素酶的酶解效果，而碱预处理可有效移除部分木质素，促进纤维素酶与底物相互接触［25］；另外，木质素的组成和结构也是影响发酵产糖效果的重要因素，原材料中的木质素含量越低，作为底物的生物利用性越好，纤维素酶解产糖量越高。牡丹枝中含有大量的木质素，碱预处理虽能有效去除木质素的愈创木基，但可能未有效破坏紫丁香基，这可能干扰了纤维素酶对纤维素的水解作用，最终导致其还原糖产量比牡丹果荚中的低。

综上，牡丹不同部位废弃物经过预处理都可用于制备发酵可利用还原糖，其中牡丹果荚的还原糖产量最高，较叶和枝提高了46.62%～110.92%；微波-碱法预处理较水浴-碱法预处理提高了牡丹三个部位材料的还原糖产量，对叶的还原糖产量影响显著，但对果荚和枝的还原糖产量影响不显著，因此，从简便且经济有效的角度考虑，水浴-碱法预处理可满足对牡丹废弃物预处理的要求，可用于后续的发酵还原糖制备。此外，本研究还使用FTIR结合GC-MS分析，从影响纤维素酶解的木质素移除效果和检出成分两方面，对两种预处理方法的处理效果进行深入探究，阐述了还原糖产量存在差异的内在因素。该研究为牡丹废弃物中木质纤维素的应用研究提供了有效的分析手段和数据，为制备发酵还原糖提供了有效原材料，为牡丹籽油生产过程中的废弃物再利用提供新思路，有效解决其弃置带来的环境危害和资源浪费。