山东晚熟桃的SCoT遗传多样性分析

李淼，李桂祥，刘伟，董晓民，高晓兰，滕兴荣，张守民，徐志芳，王孝友，张安宁

（1.山东省果树研究所，山东 泰安 271000；2.沂源县果品产销服务中心，山东 淄博 255000；3.蒙阴县果业发展服务中心，山东 临沂 276500）

桃（Amygdalus persicaL.）属蔷薇科桃属植物，落叶小乔木，原产中国。山东省是全国桃主产区，多年来栽培面积和产量稳居全国之首。桃肉质鲜美，营养丰富，深受消费者喜爱。随着桃产业的蓬勃发展，桃品种更新替代加快，越来越多的新品种涌入市场，满足并丰富果农的选择。但是，桃品种缺少一套科学严谨的分类方法，如何快速、准确对桃品种进行有效鉴定和分类成为亟需解决的问题。

DNA分子标记技术作为鉴定作物品种的主要方法之一，在指纹图谱构建、遗传关系鉴定中应用较为成熟。SCoT（start codon targeted polymorphism）分子标记，即目标起始密码子多态性标记，是一种依据植物基因中的ATG翻译起始位点侧翼序列的保守性，设计单引物并对基因组进行扩增的新型目的基因分子标记技术［1］。SCoT有别于AFLP［2］、ISSR［3］、SSR［4］、RAPD［5］等传统意义上的随机分子标记，以其成本低、引物通用性强、易操作和重复性好等多方面优势在多种作物上得到广泛应用，如猕猴桃［6］、柑橘［7］。

本研究采集山东桃产区有代表性的中晚熟桃和极晚熟桃，建立SCoT-PCR体系进行桃遗传多样性分析，为桃种质鉴定工作提供理论依据，并为果农选择品种时提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

供试11个桃品种分别为秋风蜜、金秋红蜜、肥城桃、八月脆、寒露蜜、青州蜜桃、沂蒙霜红、映霜红、中华寿桃、金牛山1号和晶白桃，详见表1。

于2019年6月18—20日采集不同桃品种成熟叶片，每种采摘10片混合均匀，用锡箔纸包装后放入液氮，尽快带回实验室于-80℃保存备用。

表1 试验用桃品种详细信息

1.2 试验方法

1.2.1 DNA提取 采用CTAB法［8］提取桃叶DNA，并用NanoDrop One微量核酸蛋白浓度测定仪检测其浓度和纯度，最后统一稀释至30 mg／L，置于-20℃保存备用。

1.2.2 SCoT引物及PCR扩增 本试验所用引物均来自植物研究中已公布的SCoT引物（表2）。SCoT-PCR反应体系（20μL）：2.5 mmol／L Mg2＋1 μL、0.3 mmol／L dNTPs 0.4μL、30 mg／L DNA模板1 μL、1.00μmol／L引物0.5μL、0.4 U Taq DNA聚合酶0.5μL、ddH2O 16.6μL。扩增程序：94℃预变性5 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃2 min，35个循环；72℃延伸10 min。PCR产物用1.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测，并在ChamlGelTM6000型凝胶成像系统上观察并拍照。

表2 SCoT引物序列信息

1.3 统计分析

对不同样品同一位置电泳胶条带有无进行赋值，有条带记为1，无条带记为0，形成（0，1）矩阵。采用NTSYS pc 2.1软件计算不同品种间的遗传相似系数，利用UPGMA法进行聚类分析，并根据遗传相似系数进行主成分分析（PCA）。

2 结果与分析

2.1 SCoT-PCR扩增产物的多态性分析

由表3可以看出，14条引物共扩增出170条清晰、整齐的条带，平均每条引物可扩增12.14条。其中，多态性条带共118条，多态性比率为50.00%～93.33%，平均多态性比率为68.43%。引物SCOT8对11个桃品种的扩增结果见图1。

表3 SCoT-PCR扩增结果

2.2 遗传距离及其遗传多样性分析

根据SCoT-PCR扩增电泳结果所转换的（0，1）矩阵表，利用NTSYS pc 2.1软件计算各品种间的遗传相似系数。由表4可知，11个桃品种间的遗传相似系数在0.37～0.89之间，平均值是0.69。其中沂蒙霜红和映霜红、金牛山1号和青州蜜桃、金牛山1号和映霜红间的遗传相似系数均较大，为0.89，表明其亲缘关系较近。秋风蜜和肥城桃的遗传相似系数最小，表明两者亲缘关系较远，因此秋风蜜具有肥城桃的遗传背景的可能性较小。11个桃品种间遗传相似系数分布0.75以上的组合有21个，占总体的38.18%，遗传相似系数小于0.75的品种占61.82%。综上可知，11个桃品种间的遗传相似性较低，遗传多样性较高。

2.3 聚类分析和主坐标分析

由图2可以看出，在遗传相似系数为0.72水平上，可以将11个桃品种分为3组。第Ⅰ组为秋风蜜和八月脆；第Ⅱ组包括7个品种：金秋红蜜、寒露蜜、青州蜜桃、沂蒙霜红、映霜红、中华寿桃、金牛山1号；第Ⅲ组包括肥城桃和晶白桃。

表4 11个桃品种间的遗传相似系数

根据遗传相似系数对桃品种进行主坐标分析，并绘制二维散点平面分布图。如图3所示，第一主坐标和第二主坐标分别解释了32.85%和15.73%的品种间相关性，累计贡献率为48.58%，能代表原始数据的主要信息。主坐标分析图中，种质材料间的距离越近，表示亲缘关系越近，反之则越远。根据种质材料间的距离可将11份桃品种分成A、B和C三组，图中分别用虚线圈出，进一步分析发现A、B组和C组与聚类分析结果（Ⅰ、Ⅱ组和Ⅲ组）高度相似，但主坐标分析更能直观清楚地显示桃品种间的亲缘关系。

3 讨论与结论

桃品种选育和优系创质的主要方式是基于实生苗选种、自然芽变选种和杂交群体选种。由于骨干亲本的重复利用，桃种质材料的形态特征具有一定相似性，这为利用外观形态特征进行辨别分类带来一定困难。

DNA分子标记技术由于其稳定、高效、不易受外界环境影响的优点，已广泛应用于果树遗传学分析，如芽变材料鉴定［9］、亲缘关系分析［10-12］和种内亚群体划分等［13］。SCoT分子标记具有高效、重复性好、应用性广、简单、成本低等优点，已经应用于茶树［14］、杨桃［15］、月季［16］、枸杞［17］、龙眼［18］、柿［19］、荔 枝［20］等 物 种 中。本 研 究 利 用SCoT标记在桃中进行种质资源遗传多样性分析，发现14条引物在11个桃品种上共扩增出170条清晰、整齐的条带，多态性水平较高（平均多态性比率为68.43%）。桃材料的遗传相似系数在0.37～0.89之间，表明所收集的桃资源内具有较高的遗传多样性。根据聚类分析和主成分分析结果，11个桃品种可分为三大类群：第一类为中熟2个品种，第二类为晚熟与极晚熟青州蜜桃群组，第三类为晚熟肥城桃群组。Ⅰ组和Ⅱ、Ⅲ组间比较发现，品种多样的遗传背景与果实的不同成熟期具有一致性，表明二者紧密相关。Ⅱ组和Ⅲ组组间比较发现，同为晚熟桃品种，以青州蜜桃和肥城桃为代表的地方名优品种分组清晰明确，说明两个组间具有成熟期之外的遗传物质多样性。

因此，利用SCoT标记对桃种质资源进行鉴定分析是十分有效的，具有较高的多态性检测率，适用于桃种质资源鉴别及亲缘关系分析，为桃资源的分类和种质的创制提供了科学依据。