中国南海周边犬类贾第虫感染情况调查与基因序列分型

王哲侃， 周浩澜， 李丹蕾， 赵阿勇

(浙江农林大学 动物科技学院，浙江 杭州 311300)

贾第鞭毛虫(Giardiaduodenalis)又称贾第虫，是一种单鞭毛寄生虫，主要寄生于人和哺乳动物的小肠，是人类最常见的肠道寄生虫[1-3]，被列为十大严重危害人类健康的寄生虫之一[4]。根据遗传学和表型的不同，可将贾第虫分为8个不同的基因型(集聚体)A～H[5-6]，其中A、B型为人兽共患型，C、D型主要感染犬类动物，E型感染有蹄动物，F型一般在猫科动物中出现，G型感染啮齿动物，H型主要感染海洋哺乳动物[6-10]。犬类主要感染犬特异性C、D型贾第虫，但也可能感染A、B型贾第虫[11-13]。野生犬感染贾第虫的概率较大[14-15]，由于贾第虫具有人犬互传的可能性，犬是否成为人贾第虫病感染的重要来源已是世界性话题。

对家犬的调查显示，不同地理区域家犬感染贾第虫的情况存在差异[16-17]，造成这种差异的原因尚不清楚，需要在不同的地理区域进行研究探讨。目前，针对中国南海及周边地区犬类感染贾第虫的调查较少，且鲜有针对海洋隔离对贾第虫地区基因分型进行的调查鉴定。因此，本研究旨在应用分子生物学方法对中国南海周边国家及地区寄生于犬类的贾第虫进行鉴定。本研究从中国广州、越南胡志明市、马来西亚吉隆坡、新加坡和菲律宾马尼拉共收集到616份犬类粪便样本，通过巢式PCR扩增TPI基因和BG基因，并通过序列比对分析，确定阳性样本中贾第虫的基因型，旨在研究海洋地域隔离是否对贾第虫分型产生影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验样品

从中国广州、越南胡志明市、马来西亚吉隆坡、新加坡和菲律宾马尼拉宠物诊所和收容所共采集犬粪便样品616份，其中流浪犬粪便样本239份，家犬粪便样本377份(表1)。粪便样品分别装入干净的自封袋，做好详细的信息记录并编号，放入4℃冰箱保存或-20℃冷冻直到分析。

表1 样品信息

1.1.2 主要试剂

Stool Genomic DNA Kit、蛋白酶K、2×Taq Master Mix购自北京康为世纪生物科技有限公司；DNA Green、平衡酚、核酸提取液I(酚、氯仿、异戊醇体积比25∶24∶1)、核酸提取液II(氯仿、异戊醇体积比24∶1)购自北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇、氯仿、异丙醇、乙二酰胺四乙酸(EDTA)购自国药集团化学试剂有限公司；DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公司；PCR清洁回收试剂盒购自爱思进生物技术(杭州)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 贾第虫DNA提取

粪样用无菌水冲洗3次，按照粪样DNA提取试剂盒说明书，采用酚抽提法提取粪便中的贾第虫DNA，采集并编号(广州1～104号，马尼拉105～269号，胡志明市270～414号，吉隆坡415～547号，新加坡548～616号)。检测DNA浓度和纯度，并将DNA样品置于-20℃保存备用。

1.2.2 引物设计

参考文献[18]方法合成巢式PCR引物，引物序列及信息见表2，由北京擎科新业生物技术有限公司进行合成。

1.2.3 巢式PCR扩增

对贾第虫基因位点进行多位点序列排序，选择Beta giardin(BG)和磷酸三脂异构酶(triose-phosphateisomerase，TPI)这2个单拷贝蛋白编码基因靶点，这2种基因多态性程度较高，利于分型。第1轮PCR反应体系为：2×TaqMix 8.5 μL，上(F1)、下(R1)游引物各1 μL，模板DNA1 μL，加灭菌水至25 μL；反应条件为：94 ℃ 2 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃ 5 min。第2轮PCR体系为：2×TaqMix 7.5μL，上(F2)、下(R2)游引物各1 μL，第1轮PCR产物1 μL，加灭菌水至25 μL；反应条件为：94℃ 2 min；94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 45 s，共35个循环；72℃ 5 min。

1.2.4 犬贾第虫基因型判定

将纯化的PCR产物送至北京擎科新业生物技术有限公司测序。将获得的核酸序列与GenBank中犬贾第虫不同基因型TPI基因(KP258395～KP258398)和BG基因(KP258342～KP258345)序列进行对比，根据结果判断其分型。

1.2.5 统计分析

将分型结果进行整理，并进行统计分析，利用卡方检验评价差异性。

2 结果与分析

2.1 粪样阳性率

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，约500bp处可见明显目的基因条带，大小与预期相符(图1、图2)。

M：DNA marker；107、110、127、137、176、185、231、273、418为贾第虫感染粪样；NC：阴性对照。M：DL 2000 DNA marker；107， 110， 127， 137， 176， 185， 231， 273， 418：Giardia duodenalis positive samples；NC：Negative samples.图1 粪样BG基因PCR扩增结果Fig.1 BG PCR products amplified from fecal samples

M：DNA marker；11、14、21、44、100、107、108、109、110、127为贾第虫感染粪样。M：DL 2000 DNA marker；11， 14， 21， 44， 100， 107， 108， 109， 110， 127: Giardia duodenalis positive samples.图2 粪样TPI基因PCR扩增结果Fig.2 TPI PCR products amplified from fecal samples

616份样品中，有48份样品见该目的条带。根据结果再次对阳性产物进行二次检验，阳性率为7.79%(48/616)。中国广州、越南胡志明市、马来西亚吉隆坡、新加坡和菲律宾马尼拉犬贾第虫感染率分别为4.81%、6.90%、9.09%、2.86%和11.52%。家犬和流浪犬贾第虫感染率分别为5.86%和9.02%(表3)。中国广州、越南胡志明市、马来西亚吉隆坡、新加坡和菲律宾马尼拉阳性样品中，BG位点阳性率分别为40%(2/5)、30%(3/10)、75%(9/12)、0%(0/2)和84.2%(16/19)，TPI位点阳性率分别为100%(5/5)、100%(10/10)、100%(12/12)、100%(2/2)和94.7%(18/19)，2个位点均呈阳性的比例是62.5%(30/48)。

表2 引物信息

2.2 基于不同基因位点的阳性样品分型结果

如表4所示，基于BG基因位点，阳性样本中鉴定为集聚体B型1例(3.33%)，集聚体C型26例(86.67%)，集聚体D型3例(10%)；基于TPI基因位点，阳性样本中鉴定为B型1例(2.12%)，集聚体C型40例(85.1%)，集聚体D型6例(12.76%)，所有地区均没有出现A型。

表3 贾第虫感染情况

表4 基于不同基因位点的阳性样品分型结果

3 讨论

贾第虫分布广泛，在欧洲、北美洲、南美洲、大洋洲和亚洲等地区均有感染的报道，尤其多见于温带和热带地区，且与当地的经济条件和卫生环境密切相关[19]。据WHO估计，全世界范围内贾第虫感染率为1%～30%，在经济水平较低、卫生条件较差的地区，感染率达到10%～20%，基因型及其分布分析对贾第虫感染的公共卫生评价具有重要的意义。

本研究所选择国家和地区处于中国南海周边，具有明显的海洋隔离特性。所有被调查国家和地区的犬都证实了有贾第虫的存在。根据目前的研究结果，贾第虫应该被认为是中国南海周边地区的一种犬类常见寄生虫。本研究对比了地区内犬群不同集聚体类型的分布，发现分布以少量集聚体B型和D型和大量集聚体C型为主，家犬与其主人的密切接触可能是导致引发人畜共患疾病的贾第虫集聚体B感染的原因，而集聚体C和集聚体D类的传播则更可能发生在生活于拥挤环境中的野生犬群中。社会和环境条件的差异也可能导致了集聚体分型的变化。然而由于弃养或偶然接触，被贾第虫集聚体C和集聚体D感染的犬类中，也偶有集聚体A和集聚体B的存在[20]。然而，在过去几年的其他的研究中，在不同国家的收容所犬身上发现了潜在的人畜共患病集聚体A和集聚体B，在比利时的研究中从BG位点上分析得到的有37.0%[21]。在西班牙的研究中从BG位点上分析则有81.4%，但集聚体A及集聚体B的感染率始终低于集聚体C和集聚体D[22]。由于不同地区环境的影响，在未来集聚体C和集聚体D感染率是否仍然会超过集聚体A和集聚体B仍然是个未知数，这也可能与不同地区的公共生活卫生水平有关[23]。从结果看，南海周边地区贾第虫基因位点C、D分型占比达到98%，并且各个地区间的分型差异并不显著，这证明海洋并没有成为阻挡贾第虫基因型分布的因素，贾第虫在该地区还以犬类感染的占比较高，随着伴侣动物的逐渐发展，越来越多的宠物犬进入家庭与人共处，在福利机构也出现野生犬类与家养犬类混居的情况，而犬类可以携带和传播贾第虫病，并通过多种途径传播给人，所以对人类健康仍然是一个潜在威胁，对于该类疾病并没有特效治疗方法，所以针对该类疾病的预防大于治疗，加强对粪便的管理和处理，保护公用水源和环境，避免污染，对于阳性结果的犬类进行隔离，避免扩大传播范围是普遍的预防手段，并且需要有数据对中国南海周边地区贾第虫病的流行病学、感染源、宿主和传播进一步了解。有必要在分型水平上使用分子工具进行监测研究和暴发调查。此外，为了使数据更具可比性，还需要在各地区之间达成共识并采用协调一致的有效方法。减少人畜生态系统中的人畜共患病和其他威胁的公共健康风险时，必须考虑人类、动物和它们所生活的各种环境之间相互作用的复杂性。这需要负责人类健康、动物健康和环境的部门之间以一种健康的方式进行沟通和合作，并且针对不同地理环境及不同公共卫生状况的地区，进行区域性调查，尽管提出的结果对于公共卫生专家、流行病学家、兽医、农民和一般公众可能更为重要，但是进一步解决数据的缺口，将大大有助于了解贾第鞭毛虫病的复杂情况，从而为今后制定适当的控制和预防计划奠定基础。