癌症中microRNAs和表观遗传之间的相互调控作用

唐德平 姚慧慧 唐金舟 毛爱红

（1. 兰州交通大学化学与生物工程学院，兰州 730070；2. 甘肃省医学科学研究院，兰州 730050）

癌症是由遗传改变和/或表观遗传改变导致的基因表达和功能异常发展而来。早期癌症研究多聚焦于肿瘤发生过程中的基因改变，如突变、基因重排和拷贝数变异等，找出癌症的“标签”。然而，随着microRNA（miRNA）和表观遗传学的快速发展，越来越多的研究证明表观遗传改变，如DNA甲基化、组蛋白修饰、异常miRNA表达也参与调控癌症的发生过程。事实上，miRNA和表观遗传标记已被确定为调控致癌/抑癌基因表达的关键因子。重要的是，表观遗传改变和miRNA异常表达会相互影响：染色质表观遗传改变导致miRNA在癌症中的表达异常，异常表达的miRNA通过靶向调控表观遗传修饰的关键酶影响染色质重塑，miRNA和染色质重塑信号通路相互关联，互相调节。令人感兴趣的是，表观遗传改变是可逆的，抑制或逆转表观遗传改变具有良好的临床应用前景。

1 表观遗传

表观遗传是研究DNA序列没有发生改变的情况，由于化学修饰等原因导致基因表达和染色质结构发生可遗传的改变。表观遗传改变包括所有与DNA序列改变无关的、可遗传的基因表达变化，涉及染色质重塑的多个过程。到目前为止，大量的表观遗传特征被确定，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、核小体重塑和组蛋白变体等。一般认为异常的表观遗传修饰启动关键的致癌途径，促进肿瘤的发生发展，是癌症发病的关键决定因素之一。本文重点讨论癌症中DNA甲基化和组蛋白修饰与miRNA的相互调控关系。

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化是目前细胞生物学领域研究最深入的表观遗传现象。主要发生在CpG岛区域。DNA甲基化是由DNA甲基转移酶（DNA methyltransferase，DNMTs）催化未甲基化的DNA甲基化和/或维持甲基化序列的甲基化。DNMT3A和DNMT3B负责DNA从头甲基化，而DNMT1则在DNMT3A和DNMT3B的辅助下，负责DNA维持甲基化。正常细胞中维持正确的DNA甲基化模式是必须的，有助于基因组印记和X染色体失活的建立。异常的DNA甲基化模式与多种疾病密切相关，如乳腺癌中的BRCA1（Breast Cancer 1，BRCA1）和结肠癌中的MLH1（MutL Homolog 1，MLH1）超甲基化，胰腺癌中的MASPIN（Mammary serine protease inhibitor，MASPIN）和多发性硬化中的PADI2（Peptidylarginine Deiminases，PADIs）低甲基化［1］。有趣的是，在癌细胞中，DNA高甲基化沉默抑癌基因，而低甲基化激活致癌基因［2］。此外，异常DNA低甲基化也可导致DNA螺旋断点，最终造成杂合性丢失（Loss of heterozygosity，LOH）或异常染色体重组。DNA甲基化异常是人类癌症检测和治疗的一个重要指标［3］。

1.2 组蛋白修饰

组蛋白是一类含有球状域和带电-NH2末端尾巴的、构成核小体的基础蛋白。基因表达调控可通过组蛋白尾巴翻译后修饰发生，包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、类泛素化和脯氨酸的异构体、ADP-核糖基化。这些修饰代表了存储在组蛋白中的表观遗传信息，又称为组蛋白密码，能够影响DNA与组蛋白及其他DNA结合蛋白复合物的相互作用，在基因表达调控中发挥重要作用。组蛋白修饰的异常是癌症中常见的现象［4］。

组蛋白乙酰化是基因转录的主要调控机制，通过调控组蛋白乙酰转移酶（Histone acetyltransferase，HATs）和组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDACs）活性进行相互平衡。组蛋白尾巴含有一些可被乙酰化的赖氨酸残基，如与转录活化相关的乙酰化位 点H3K9ac、H3K14ac、H3K18ac和H4K5ac（图1）。组蛋白乙酰化调控一系列功能，包括组蛋白与DNA结合，转录因子活性，亚细胞定位和蛋白质稳定性。另外，组蛋白乙酰化也可介导其它功能，如DNA修复（H4K8ac、H3K56ac）和染色质重塑（H4K16ac、H2BK12ac）［5］。除组蛋白外，其他各种参与转录、翻译、拼接、DNA修复、细胞周期进展、蛋白折叠、细胞骨架动力学、信号转导和新陈代谢的蛋白都对乙酰化敏感。

除组蛋白乙酰化外，组蛋白甲基化也与基因的转录激活和抑制相关。组蛋白甲基化是一类比乙酰化改变更为复杂的表观遗传标志［6］。首先，它作为组蛋白赖氨酸残基的单甲基化、二甲基化或三甲基化，及精氨酸残基的单甲基化和二甲基化存在。第二，特定残基甲基化水平决定了其表观遗传标记功 能。例 如，H3K4me3、H3K36me3、H3K79me3、H4R3me1和H4K20me1与基因转录激活有关；而H3K9me3和H3K27me3与基因沉默有关（图1）。第三，组蛋白甲基化标记分布和核小体定位是可变的，并依赖于基因组区域的功能和活性。例如，H3K4me3和H3K79me3在活性启动子更为突出，H3K4me1常见于增强子区域，而H4K20me1和H3K36me3则定位于活性转录基因的基因体。但最近的数据表明，单个的组蛋白改变不足以影响基因表达，它们以组合模式调节转录［7］。

虽然DNA甲基化标记相对稳定，但组蛋白修饰是动态的、不断变化的。特定组蛋白修饰之间相互影响，如H2B泛素化是H3K4me3甲基化所必需的。此外，一些研究表明，DNA甲基化和组蛋白修饰密切相互作用，调控基因表达，如DNA甲基化允许MeCP2（methyl-CpG-binding proteint 2，MeCP2）结合，然后再募集HDACs，通过染色质凝聚，进一步使基因转录失活（图1）。

图1 DNA甲基化和组蛋白修饰控制基因表达的示意图［8］

2 miRNAs

miRNAs是一类内源性、非编码小RNAs（约22 nt），在转录后水平调节基因表达。miRNAs通过与 靶mRNA的3'-UTR（3'-Untranlated Regions，3'-UTR）碱基完全或不完全配对，调节靶mRNA的稳定性或抑制靶mRNA翻译。一个miRNA可调节上百个基因表达，一个基因也可被多个miRNAs调节。miRNAs及其靶基因组成一个复杂的相互作用网络，几乎参与调控恶性肿瘤相关的所有过程，包括肿瘤细胞增殖、分化、凋亡、侵袭及转移。另外，miRNAs与肿瘤干细胞特征，上皮-间质转化（Epithelial-mesenchymal transition，EMT），肿瘤侵袭和转移，放/化疗治疗应答密切相关，具有应用到癌症临床诊断和治疗的前景。事实上，在几乎所有的人类癌症中，miRNA组（miRNoma）异常是癌症的一个标志，可以作为癌症分类、病理诊断及预后的标记物［9］。

目前已知，大约45%的miRNAs来自非编码RNA转录本，其他来自蛋白编码位点，主要由RNA聚合酶II转录。miRNA基因被转录为初级 转 录 本（pri-microRNA），然 后 由Drosha-like RNase III内切核酸酶或剪接体成分剪切，形成前体miRNA（pre-microRNA），pre-microRNA由Ran-GTP受体和Exportin-5从细胞核输出到细胞质。在细胞质中，通过Dicer切割pre-microRNA形成成熟的miRNAs。成熟miRNAs被整合到一个核糖核粒子（Ribonucleoprotein，RNP）中，形成RNA诱导的基因沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC），在转录后抑制靶mRNA的活性（图2）。

尽管miRNAs不被认为是真正的表观遗传调控因子，但miRNAs与其它关键的表观遗传调控因子密切相关，可通过靶向调控表观遗传修饰的关键酶参与表观遗传调控。miRNAs不仅影响表观遗传，同时它们也受到表观遗传的调控。表观遗传和miRNAs之间存在一个相互作用的、复杂的基因表达调控网络。

3 表观遗传调控miRNA表达

表观遗传通过多种方式调控miRNAs生物合成和表达过程（图2）。已有大量证据表明，大多数参与癌症发生的miRNAs常位于基因组的脆性位点，且在卵巢癌、乳腺癌和黑色素瘤中得到证实；另外，癌症中异常表达的miRNAs也可能是由于miRNAs生成机器缺失，如DROSHA或DICER表达和功能改变，或转录因子活性的改变［10］。随着miRNA研究的深入，miRNAs基因组序列深度分析表明，大约一半的miRNAs启动子区与CpG岛相关，这表明miRNAs的生物合成可能受DNA甲基化的调控。

早期的研究发现，在HCC细胞系和原代人肝细胞癌，miR-1甲基化，而在DNMT-/- HCT116细胞低甲基化并被激活［11］；而miR-124a是唯一在正常组织未甲基化，而在肿瘤组织中超甲基化且沉默的miRNA，在DNMT1和DNMT3b缺失的结直肠癌细胞中被诱导上调表达［12］。这说明，microRNA基因的甲基化调控由特定DNMTs实施。事实上，用DNMT抑制剂5-Aza-2'-脱氧胞苷处理不同的癌细胞，发现一些在癌细胞中沉默的miRNAs被诱导上调表达，如miR-127、miR-9、miR-148a、miRNA-129、miR-181c、miR-107、miR-200c/miR-141基因簇、miR-34和miR-29家 族［10，13］。这 些miRNAs的 异常超甲基化与癌细胞侵袭和转移相关。相反，一些具有致癌作用的miRNAs在人类癌症中表达上调，是由于DNA低甲基化而被激活。如肺癌中的let-7a-3［14］和卵巢癌中的miR-21［15］。通过DNA 超甲基化沉默抑癌基因或低甲基化激活癌基因，代表了癌细胞所使用的一种有利于生存、增殖和癌症进展的机制。

图2 miRNAs生物合成和表达过程受表观遗传调控［10］

启动子甲基化不是表观遗传影响miRNAs表达的唯一机制，组蛋白修饰在调控癌细胞miRNAs的表达中也发挥着关键作用。Scott等［16］研究表明，在SKBR3乳腺癌细胞中，抑制组蛋白脱乙酰酶活性导致miRNAs表达发生广泛而快速的变化。Vrba等［17］发现，转录激活修饰H3Ac和H3K4me3的缺失，和抑制性H3K9me2H3表观遗传标记的出现，导致miR-200c/141在乳腺癌细胞中低表达。另外，不同组织中58%的miRNAs通过启动子区H3K27me3沉默［18］。有趣的是，miR-29家族成员不但受组蛋白去乙酰化和三甲基化调控，而且还受DNA甲基化调控［19］。表明，一个miRNA可同时受到DNA甲基化和/或组蛋白修饰调控。

miRNAs和表观遗传之间的相互作用是复杂的，表观遗传能够调控miRNAs的表达，反过来，miRNAs也能够通过靶向调控DNA和组蛋白甲基化或乙酰化作用的关键酶，参与调控表观遗传。

4 miRNAs调控表观遗传

与表观遗传调控miRNAs的表达情况不同，miRNAs自身可调节表观遗传元件表达，形成一个严格控制的反馈机制，这些被称为“epi-miRNAs”的miRNAs异常表达，通常与癌症的发生或进展相关。既受表观遗传调控，又可调控表观遗传元件表达的miRNAs，如图3所示。

miR-29家族参与调控催化DNA甲基化的DNMT3A和3B的 活 性，是epi-miRNAs存 在 的 第一个证据。在肺癌中，miR-29家族成员直接与DNMT3A和3B的3'-UTR结 合，抑 制DNMT3A和3B的表达［20］。在肺癌中，高表达的DNMT3A和3B通过沉默抑癌基因促进肿瘤生长；抑制DNMTs表达导致DNA低甲基化和肿瘤抑制因子pI5（INK 4b）和ESR1的重新表达。随后，miR-29通过靶向DNMTs抑制肿瘤生长的作用在各种癌症中得到证实［19］。另外，miR-29b不仅能够直接与DNMT3A和3B结合，而且还能够通过其反式激活因子Sp1间接作用于DNMT1，高水平表达的miR-29b引起基因组DNA低甲基化，导致抑癌基因重新表达［21］。

图3 表观遗传调控的miRNAs和Epi-miRNAs

后来研究发现DNMTs受到各种miRNAs的调控，包括miR-152、miR-148a、miR-185、miR-302、miR-342及miR-17-92簇的各个miRNA成员。在乳腺癌细胞中，一方面由于miR-148a和miR-152启动子区被DNMT1甲基化而表达下调；另一方面，DNMT1又是这些miRNAs的直接靶；miR-148a和miR-152下调增加IGF-IR和IRS1在乳腺癌中的表达，诱导肿瘤生长和血管生成［22］。在顺铂耐受的卵巢癌中，miR-152和miR-185表达下调，其靶点DNMT1表达水平升高；过表达miR-152和miR-185抑制细胞增殖、促进凋亡，提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性［23］。miR-17-92簇在DNA甲基化水平上受DNMT1调控，而DNMT1又被该基因簇miRNAs靶向调控，从而形成一个双重负反馈回路［24］。

另外，调节组蛋白修饰的酶也直接受epimiRNAs的调控。EZH2是PRC2的一个保守催化区域。由 于miR-26a、miR-101、miR-205和miR-214的特异性下调，EZH2在各种癌症中高表达。在肝癌细胞中，miR-101靶向PRC2复合物的2个亚单位：EZH2和EED；抑制miR-101表达导致PRC2活性增加及肝癌发生［25］。在脑胶质瘤，miR-128下调导致PCR2复合物成份Bmi-1过表达，通过染色质重塑造成肿瘤干细胞群自我更新［26］。转录因子YY1受miR-29家族成员，特别是miR-29b/c的调控［27］，而YY1可将PRC2复合物和HDAC1招募到特定的基因组位置，通过调节染色质结构控制多个细胞过程，包括凋亡、细胞周期和肿瘤发生。此外，在细胞中，PRC2在生理功能上与HDACs相关，而HDACs受到多个miRNAs的调控，包括miR-1、miR-21、miR-29、miR-140、miR-155、miR-200a及miR-449家族［19，28-30］。在前列腺癌细胞中，miR-449a靶向抑制HDAC1表达，诱导细胞周期阻滞，凋亡和衰老 样 表 型［29］。而miR-140、miR-155和miR-200a直接通过下调HDAC4表达，整体上调组蛋白乙酰化［15，30-31］。而Sirt1是另一种组蛋白去乙酰化酶，通过压缩染色质结构发挥转录抑制作用。已有研究证明，Sirt1受miR-138调控，而miR-138又被Sirt1抑制，miR-138和Sirt1之间形成一个双重负反馈回路［32］。以上证据表明，miRNA和表观遗传之间形成一种复杂的调控网络，来严格控制基因表达。这一复杂网络成员的平衡改变将会导致病理条件的发生，如癌症（图4）。因此，使用miRNA直接调节基因表达或通过靶向表观遗传效应酶来控制表观遗传，从而影响广泛的调节分子表达，逆转癌症中的异常基因表达，具有极大的临床应用前景。

5 结语

图4 癌症中miRNAs和表观遗传修饰之间的相互作用反馈回路

近年来，关于表观遗传修饰与miRNA相互作用的报道不断出现。越来越多的证据表明，miRNA可以通过靶向抑制表观遗传关键酶来影响表观遗传；反之，表观遗传（如DNA甲基化和组蛋白修饰）也能影响miRNA的表达。表观遗传-miRNA相互作用的调控网络为癌症治疗提供了一个非常有价值的靶点。表观遗传疗法（如DNMTs抑制剂5-Aza和HDAC抑 制 剂SAHA及miRNA mimics或inhibitors）在癌症的治疗中已显示出很好的前景［33-34］。目前，一 些miRNA mimics，如miR-34的MRX34或miR-107、miR-101和miR-16等mimics，已处在药物开发和临床试验的不同阶段，但如何有效地将小分子核酸运送到癌组织并被细胞吸收，仍是一个具有挑战性的问题。考虑到miRNAs和表观遗传之间存在相互作用，表观遗传关键酶抑制剂和/或联合miRNA mimics可能是癌症更有前景的治疗策略。