高灵敏度real-timePCR在低病毒载量病毒性肝病中的临床应用价值

陈鹏 孙玉良 邓星

[摘要] 目的 評估高灵敏度实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）在病毒性肝病病毒核酸定量检测中的临床应用价值，为该方法的普及应用提供依据。 方法 收集2016年1月～2018年12月于湖北省中医院（以下简称“我院”）就诊的病毒性肝病患者895例，同期选取我院100名健康体检者作为对照组。分别应用常规方法和高灵敏度real-time PCR方法检测血清病毒核酸载量，比较两种方法检测结果的差异。对其中低病毒载量患者的生物化学指标、免疫学指标、凝血国际标准化比值（INR）和肝纤维化FIB-4指数的变化趋势、特点及其与病毒核酸载量的相关性进行统计分析。 结果 受检人群中低病毒载量患者呈高比例分布。高灵敏度real-time PCR方法检测HBV DNA的阳性率远高于常规方法（P < 0.05），而对于HCV RNA，两种方法检测结果的一致性较好。低病毒载量患者的多项生物化学指标波动并不明显，且多项生物化学指标与病毒核酸载量无相关性（P > 0.05）。大部分低病毒载量乙肝患者表现为HBeAg阴性的低水平复制状态。免疫学诊断指标与病毒核酸载量间存在不同程度的不一致和弱关联度。低病毒载量患者的凝血INR和肝纤维化FIB-4指数均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但其与病毒核酸载量无相关性（P > 0.05）。 结论 高灵敏度real-time PCR方法对病毒核酸载量的检测具有不可比拟的优势，结合其他的诊断指标，其可在低拷贝病毒性肝病的病程管理中发挥不可替代的重要作用。

[关键词] 高灵敏度;实时荧光定量聚合酶链反应;病毒性肝病;病毒核酸定量;低病毒载量

[中图分类号] R446          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（a）-0151-05

[Abstract] Objective To evaluate the clinical application value of high-sensitivity real-time polymerase chain reaction （real-time PCR） in the quantitative detection of viral nucleic acid in viral hepatitis， and to provide the basis for the widespread application of this method. Methods A total of 895 patients with viral hepatitis were enrolled from January 2016 to December 2018 in Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine （hereinafter referred to as “our hospital”）， and meanwhile another 100 normal people in our hospital were recruited as control group. Serum viral loads were detected by routine and high sensitive real-time PCR， then the difference of results between the two methods was compared. The trends and characteristics of biochemical indices，immunological markers， international standardized ratio of coagulation （INR）， index of liver fibrosis FIB-4 and their correlation with viral load were analyzed statistically in viral hepatitis patients with low viral load. Results The proportion of patients with low viral load was high among the population surveyed. The positive rate of HBV DNA detected by real-time PCR with high sensitivity was much higher than that by routine method（P < 0.05），but for HCV RNA， the two methods showed good consistency. The fluctuation of several biochemical indices was not obvious in low viral load patients， and multiple biochemical indexes were not correlated with viral nucleic acid load （P > 0.05）. Most hepatitis B patients with low viral load showed a status of low level HBeAg-negative replication. There were different degrees of inconsistency and weak correlation between immunological diagnostic markers and viral load results. INR of coagulation and FIB-4 index of liver fibrosis in patients with low viral load were higher than those in the control group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）， but there was no correlation between them and viral nucleic acid load （P > 0.05）. Conclusion High sensitivity real-time PCR has incomparable advantages in the detection of viral nucleic acid，combined with other diagnostic markers，it can play an irreplaceable role in the course management of low viral load hepatitis.

[Key words] High sensitivity; Real-time polymerase chain reaction; Viral hepatitis; Viral nucleic acid quantification; Low viral load

由乙型肝炎病毒（HBV）和/或丙型肝炎病毒（HCV）引起的病毒性肝炎及其并發症是世界性的公共卫生问题，根据精准化的检测结果进行规范化的抗病毒治疗可有效地改善患者的生活质量[1-2]。病毒核酸的载量是临床确诊病毒性肝病的重要依据，也是反映病毒活动状态最直接、最可靠的观察指标，在病毒性肝病的诊断和治疗等多个方面均具有重要的参考价值，由此，应用高效的检测方法对病毒核酸进行精准定量便成为了规范化诊疗的关键所在[3-4]。当前，基于基因扩增技术的实时荧光定量聚合酶链反应（real-time PCR）已成为病毒核酸定量检测的“金标准”，但囿于技术上的落后和方法学上的差异，相对于国外产品，国产试剂盒的检测性能还有较大差距，尤其对于低载量病毒的动态监测仍存在不同程度的盲区，极大地限制了病毒性肝病患者的诊断和治疗[5-6]。为此，本研究仅选取低病毒载量的病例，了解其流行病学特征并分析不同诊断指标的变化及与病毒核酸的相关性，以评估高灵敏度real-time PCR在病毒性肝病诊断和治疗中的临床应用价值，为高灵敏度技术在精准医疗中的普及应用提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2016年1月～2018年12月在湖北省中医院（以下简称“我院”）门诊或住院治疗的895例患者作为研究对象，其中男551例，女344例;年龄18～84岁，平均（47.78±14.10）岁。同期选取我院100例健康体检者作为对照组，其中男62例，女38例，年龄20～76岁，平均（45.14±14.64）岁。纳入标准：年龄≥18周岁;就诊前未接受抗病毒治疗或停止治疗3年以上;临床诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》[7]和《丙型肝炎防治指南（2015更新版）》[8]中的诊断标准。排除标准：①合并其他肝炎病毒或嗜肝病毒感染;②脂肪肝、代谢性肝病、自身免疫性肝炎、酒精性肝病及其他原因（药物、寄生虫）引起的肝功能异常;③罹患其他器官严重疾病;④使用影响凝血功能的药物;⑤因感染、免疫性、肿瘤或治疗等原因所致的血小板（PLT）降低。低病毒载量患者与健康体检者一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究获得我院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

①Sysmex XN9000血细胞分析仪及配套质控品和试剂;②Sysmex CA7000凝血分析仪，质控品和试剂购自上海太阳生物公司;③Beckman-CoIUlter AIU5800生化分析仪，校准品和试剂全部由宁波美康生物科技有限公司提供，质控品购自美国Bio-Rad公司;④ARCHITECT i2000SR化学发光微粒子免疫检测系统及质控品和试剂由美国雅培公司提供;⑤Mx3000P型荧光定量PCR仪购自Agilent Technologies公司，常规病毒核酸定量采用国产real-time PCR试剂盒，高灵敏度病毒核酸real-time PCR检测仪及试剂盒均来自于某国际标准化检测系统。

1.3 观察指标

①PLT计数：采集患者外周血进行血液学常规检验。②国际标准化比值（INR）测定：检测血浆凝血酶原时间（PT）并计算INR。③肝功能指标检测：检测患者血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、谷氨酰转肽酶（GGT）、碱性磷酸酶（ALP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLO）、总胆红素（TBIL）、结合胆红素（DBIL）、总胆汁酸（TBA）、胆固醇酯（CHE）和总固醇（CHO）水平。④免疫学检验：定量检测血清甲胎蛋白（AFP）、乙肝五项和丙肝抗体。⑤病毒核酸定量：平行测定。常规检测采用煮沸高速离心法（HBV）和柱洗脱法（HCV）提取核酸，加入Taq酶进行核酸扩增，检测线性范围为1.0×102～5.0×108 IU/mL（HBV）和1.0×103～1.0×107 IU/mL（HCV）;高灵敏度检测使用磁珠捕获法提取核酸，加入尿苷酶（AmpErase）和脱氧尿苷三磷酸（dIUTP），应用ZO5（和）ZO5D DNA聚合酶进行选择性扩增，检测线性范围为2.0×10～1.7×108 IU/mL（HBV）和1.5×10～1.0×108 IU/mL（HCV）。以HBV DNA<100 IU/mL或HCV RNA<1000 IU/mL归类为低病毒载量患者。⑥基于4因子的肝纤维化指数（FIB-4）指数：FIB-4=（年龄×AST）/（PLT×ALT的平方根）。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件对所得数据进行分析，数据的正态性检验用非参数Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk检验，非正态分布计量资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，两组资料间比较采用非参数Mann-Whitney U秩和检验，相关性分析采用Spearman等级相关方法。计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。检测结果的对比分析采用关联度分析及一致性检验（Kappa）和优势性检验（McNemar）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病毒性肝病患者血清病毒核酸载量检测结果分布

全部受检样本共检出HBV DNA阳性333例（占63.92%），HCV RNA阳性43例（占11.50%）。479例乙肝患者中检出HBV DNA载量低于500 IU/mL 367例（占76.62%），低于100 IU/mL 319例（占66.60%）;245例丙肝患者中检出HCV RNA载量低于1000 IU/mL 219例（占89.39%）。见表1。

常规方法和高灵敏度real-time PCR方法HBV DNA检测结果比较，一致性较差（Kappa = 0.039，rp = 0.141，P < 0.05），高灵敏度real-time PCR方法的阳性率（48.43%）远高于常规方法（33.40%）;对于HCV RNA，两种方法检测结果的一致性較好（Kappa = 0.709，rp = 0.579，P > 0.05）。

2.2 低病毒载量患者与健康人群生物化学指标的比较

除HBV组的ALB和GLO外，低病毒载量患者的多项生物化学指标与对照组比较，均有不同程度的变化（P < 0.05），但其波动幅度并不明显。此外，秩相关分析的结果也显示除HBV DNA与ALT有低相关性（P < 0.05），低病毒载量患者的多项生物化学指标与病毒核酸载量无相关性（P > 0.05）。见表2～3。

2.3 免疫学指标

895例研究对象中同时检测乙肝免疫学标志物和病毒核酸载量共377例，其中受检的355例乙型肝炎表面抗原（HBsAg）阳性样本中有110例未检出病毒核酸，同时，22例HBsAg阴性患者有6例HBV DNA阳性。256例低病毒载量乙肝患者的免疫学指标多表现为乙型肝炎e抗原（HBeAg）阴性的低水平复制状态[214例（83.59%）]，其次为HBeAg阳性模式，两类模式（1-3-5和1-4-5）的分布比例明显高于其他模式，差异有统计学意义（χ2=110.3，P < 0.05）。见表4。相关性分析显示低病毒载量乙肝患者的HBV DNA与HBsAg、HBeAg浓度均具有相关性（P < 0.05），但关联度较弱（HBsAg：rs=0.277;HBeAg：rs=0.189）。此外，低病毒载量患者中AFP的阳性率较低（HBV：9.95%;HCV：15.74%），其与病毒核酸载量无相关性（HBV DNA：rs = 0.060;HCV RNA：rs = -0.069，P > 0.05）。

2.4 其他诊断指标

低病毒载量患者的凝血INR和FIB-4指数均高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），但其与病毒核酸载量无相关性（INR：HBV：rs = 0.013;HCV：rs = 0.035，P > 0.05;FIB-4：HBV：rs = 0.030;HCV：rs = 0.046，P > 0.05）。见表5。

3 讨论

感染性疾病的诊疗应按照循证医学的原则来进行。目前，病毒核酸的载量仍是评估病毒性肝病进展的核心指标，准确的病毒核酸检测结果也是病程管理的重要依据[9-10]。由此，规范化的精准诊疗目标和病毒性肝病管理与治疗的现行指南均明确指出，对病毒核酸的定量必须使用灵敏度高且线性范围广的检测方法[11-15]。荧光定量PCR是目前临床实验室病毒核酸载量检测常用的方法，而高灵敏度real-time PCR则在方法学上做了进一步的优化，大大提高了核酸检测的性能，尤其对于低拷贝病毒的精准定量，具有其他方法不可比拟的优势。

高灵敏度PCR检验技术是病毒感染性疾病重要的诊断方法。值得注意的是临床上低病毒载量患者的高比例分布，尤其是处于常规方法检测限以下的病例。由于这部分患者病毒的拷贝数并不在常规检测的线性范围内，不精准的定量结果将导致误诊和漏诊的可能。而对比分析的结果显示高灵敏度real-time PCR能提供更低的拷贝量和更高的检出率，几乎做到了对低载量病毒的“全覆盖”，这对于病毒感染性疾病的精准诊疗具有重要的意义。此外，对于丙肝病毒核酸，两种方法定量检测的关联度较好，究其原因可能与病毒载量的两极化分布有关。

核酸载量的变化对于病毒活动状态的评估具有不可替代的作用。本研究的数据分析显示肝炎病毒的活动对肝功能有显著影响，但肝功能的变化并不能单独作为低病毒载量患者病毒活动评估的直接依据。生物化学指标的变化是整个有机体生物学功能的外在表现，受到多种外在因素的影响，具有代偿性、非特异性的特点。此外，已有研究[16-18]表明肝炎病毒在患者体内的分布存在不均一性，其区域化的差异也会导致血清生物化学指标与病毒核酸载量变化的不一致，本研究中多名生物化学指标异常而血清病毒核酸载量为零的病例也验证了这一现象的存在。

病毒核酸的载量是病毒感染性疾病临床诊断、疗效观察最直接、最可靠的依据。由于窗口期的存在、抗原表位的变化、抗原来源的多样性、检测方法的局限性等原因，免疫学标志物与病毒核酸载量的变化并不完全同步[19-21]。本研究的统计结果充分显示相较于病毒核酸，免疫学标志物并不能及时、有效地反映病毒的存在及其复制情况，单独依据免疫学标志物来评估低拷贝病毒性肝病患者的病情仍存在缺陷[22]。与此同时，由于病毒核酸的持续复制是导致病情反复和进展的主要原因，多篇文献[21，23-24]报道和相关诊疗指南也皆强调以病毒核酸载量及其变化作为病毒应答评判和临床治疗决策的指征，这些结论也进一步证实了高灵敏度分子诊断方法在病毒性肝病治疗监测中的重要作用。

由于潜在的肝损伤和继发并发症的高风险，应用高灵敏度的核酸检测方法对低病毒载量病毒性肝病患者进行常规检测是十分有必要的[25]。有研究显示[26]，FIB-4和INR在高病毒载量感染或肝功能严重受损失代偿时能很好地预测肝脏的病理风险和生理功能，但在低病毒载量患者或肝损伤早期，其并不能替代病毒核酸载量有效地评估肝损害，本研究中FIB-4和INR指数的分析结果与此一致。

综上所述，高灵敏度real-time PCR是病毒核酸载量重要的检测方法，结合其他的诊断指标，其能够为低病毒载量患者提供更加精准的定量结果，在病毒性肝病的病程管理中具有较高的临床实用价值。

[参考文献]

[1]  Sun YT，Zhang YX，Tang H，et al. Clinical characteristics and current management of hepatitis B and C in China [J]. World J Gastroenterol，2014，20（37）：13582-13590.

[2]  Qin Q，Smith MK，Wang L，et al. Hepatitis C virus infection in China：an emerging public health issue [J]. J Viral Hepat，2015，22（3）：238-244.

[3]  Strassl R，Rutter K，St？覿ttermayer AF，et al. Real-time PCR assays for the quantification of HCV RNA：concordance，discrepancies and implications for response guided therapy [J]. PLoS One，2015，10（8）：e0135963.

[4]  周惠娟，谢青.精准医学时代中国丙型肝炎诊疗一体化的病毒学应答指导治疗策略[J].临床肝胆病杂志，2016， 32（7）：1262-1265.

[5]  Cai SH，Lv FF，Zhang YH，et al. Dynamic comparison between Daan real-time PCR and Cobas TaqMan for quantification of HBV DNA levels in patients with CHB [J]. BMC Infect Dis，2014，14：85.

[6]  Villar LM，Cruz HM，Barbosa JR，et al. Update on hepatitis B and C virus diagnosis [J]. World J Virol，2015，4（4）：323-342.

[7]  中華医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）[J].中华肝脏病杂志，2015，23（12）：888-905.

[8]  中华医学会肝病学分会，中华医学会感染病学分会.丙型肝炎防治指南（2015更新版）[J].中华肝脏病杂志，2015， 23（12）：906-923.

[9]  Singh MP，Galhotra S，Saigal K，et al. Quantitative nucleic acid amplification methods and their implications in clinical virology [J]. Int J Appl Basic Med Res，2017，7（1）：3-9.

[10]  陈合民，邵国辉.核苷和核苷酸类药物治疗慢性乙型肝炎停药标准的探讨[J].临床肝胆病杂志，2016，32（7）：1283-1286.

[11]  European Association for Study of Liver. EASL Clinical Practice Guidelines：management of hepatitis C virus infection [J]. J Hepatol，2014，60（2）：392-420.

[12]  European Association for Study of Liver. EASL Recommendations on treatment of hepatitis C 2015 [J]. J Hepatol，2015，63（1）：199-236.

[13]  Terrault NA，Bzowej NH，Chang KM，et al. AASLD guidelines for treatment of chronic hepatitis B [J]. J Hepatol，2016，63（1），261-283.

[14]  European Association for the Study of the Liver. EASL 2017 Clinical Practice Guidelines on the management of hepatitis B virus infection [J]. J Hepatol，2017，67（2），370-398.

[15]  World Gastroenterology Organisation. World Gastroenterology Organisation global guidelines：diagnosis，management，and prevention of hepatitis C（2017 update）[EB/OL]. World Gastroenterology Organisation，2017.

[16]  刘立，刘春云，王霖，等.低水平HBsAg患者肝组织HBsAg、HBcAg表达与血清HBsAg水平、HBV DNA载量的相关性[J].实用医学杂志，2017，33（21）：3639-3642.

[17]  Tripodi G，Larsson SB，Norkrans G，et al. Smaller reduction of hepatitis B virus DNA in liver tissue than in serum in patients losing HBeAg [J]. J Med Virol，2017， 89（11）：1937-1943.

[18]  Wang H，Fang M，Gu X，et al. The intracellular HBV DNAs as novel and sensitive biomarkers for the clinical diagnosis of occult HBV infection in HBeAg negative hepatocellular carcinoma in China [J]. PLoS One，2014，9（9）：e107162.

[19]  Arora S，Doda V，Kirtania T. Sensitivity of individual donor nucleic acid testing（NAT） for the detection of hepatitis B infection by studying diluted NAT yield samples [J]. Blood Transfus，2015，13（2）：227-232.

[20]  Khadem-Ansari MH，Omrani MD，Rasmi Y，et al. Diagnostic validity of the chemiluminescent method compared to polymerase chain reaction for hepatitis B virus detection in the routine clinical diagnostic laboratory [J]. Adv Biomed Res，2014，3：116.

[21]  Laperche S，Nübling CM，Stramer SL，et al. Sensitivity of hepatitis C virus core antigen and antibody combination assays in a global panel of window period samples [J]. Transfusion，2015，55（10）：2489-2498.

[22]  Liu C，Chang L，Ji H，et al. Prevalence of HBV DNA among 20 million seronegative blood donations in China from 2010 to 2015 [J]. Sci Rep，2016，11（6）：1-7.

[23]  Cheng J，Dai Y，Yan L，et al. Clinical characteristics and correlation analysis of subjects with chronic hepatitis B virus （HBV） infection and sustained low levels of hepatitis B surface antigen（HBsAg）[J]. Med Sci Monit，2018， 24：1826-1835.

[24]  Jiang JN，Huang ZL，He LX，et al. Residual amount of HBV DNA in serum is related to relapse in chronic hepatitis B patients after cessation of nucleos（t）ide analogs [J]. J Clin Gastroenterol，2015，49（4）：323-328.

[25]  Liu YP，Yao CY. Rapid and quantitative detection of hepatitis B virus [J]. World J Gastroenterol，2015，21（42）：11954-11963.

[26]  康曉征，赵勇，蒋善珍，等.FIB-4指数联合天冬氨酸氨基转移酶与血小板比值对HBV患者治疗后病情转归的预测价值[J].实用医学杂志，2018，34（11）：1782-1786.

（收稿日期：2019-11-18）