藏药普尔那不同部位体外抑菌及抗肿瘤活性研究

李磊 崔鹤蓉 王鹏龙

[摘要] 目的 研究藏药普尔那不同部位不同提取物的体外抗耐药菌和抗肿瘤活性。 方法 对藏药普尔那茎和叶分别采用无水乙醇、乙酸乙酯进行成分提取。采用K-B纸片法、比浊法及平板划线法，评价不同提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抑菌活性。MTT法检测不同提取物对人肝癌细胞系HepG2细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞的抑制率。 结果 37℃培养18 h后，普尔那叶无水乙醇提取物（100.00 mg/mL）对MRSA（1×107 cfu/mL）抑制作用最强（5.00 mm），最低抑菌浓度（MIC）为1.25 mg/mL，最低杀菌浓度（MBC）为5 mg/mL。高浓度（500.00 μg/mL）普尔那叶乙酸乙酯提取物对人肝癌细胞系HepG2细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞均表现出最佳的抑制活性。 结论 普尔那叶乙醇提取物对MRSA体外抑耐药菌效果更佳，而普尔那叶乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性更好。

[关键词] 藏药;普尔那;耐甲氧西林金黄色葡萄球菌;抗耐药菌;抗肿瘤

[中图分类号] R291.4          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）07（b）-0017-04

[Abstract] Objective To study on anti-drug resistant bacteria and antitumor activity of different parts from different parts of Tibetan medicine Artemisia vestita in vitro. Methods Stem and leaf of Artemisia vestita were extracted with absolute ethanol and ethyl acetate respectively. The antibacterial activity of different extracts on Methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） was evaluated by K-B paper method， turbidimetric method and flat line marking method. The MTT method was used to detect the inhibition rate of different extracts on human hepatoma cell line HepG2 cells and human cervical cancer cell line HeLa cells. Results After incubation at 37°C for 18 h， the Artemisia vestita leaf absolute ethanol extract （100.00 mg/mL） had the strongest inhibitory effect （5.00 mm） on MRSA （1×107 cfu/mL）， and the lowest inhibitory concentration （MIC） was 1.25 mg/mL， the minimum germicidal concentration （MBC） was 5 mg/mL. Highconcentration （500.00 μg/mL） Artemisia vestita leaf ethyl acetate extract showed the best inhibitory activity against human hepatoma cell line HepG2 cells and human cervical cancer cell line HeLa cells. Conclusion Artemisia vestita leaf ethanol extract has better anti-drug resistance to MRSA in vitro， while Artemisia vestita leaf ethyl acetate extract has better antitumor activity.

[Key words] Tibetan medicine; Artemisia vestita; Methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Anti-drug resistant bacteria; Antitumor

普爾那是菊科植物毛莲蒿的地上部分，味苦、辛，性寒，具有清热解毒、杀虫、止血等功效[1-3]。普尔那中主要含有挥发油、香豆素、有机酸、黄酮、甾体类等多种成分[4-8]，具有抗寄生虫[9-10]、抗炎[11-12]、抗肿瘤[13]、抑菌[14-16]等作用。细菌的耐药问题及肿瘤的高发病率、高死亡率严重威胁人类健康[17-19]。本研究对藏药普尔那茎和叶分别采用无水乙醇、乙酸乙酯进行成分提取，再对提取物进行体外抗耐药菌及抗肿瘤活性研究，从而为促进藏药开发及从天然产物中寻找抗耐药菌、抗肿瘤的药物提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

旋转蒸发仪（RE-2000A，上海亚荣生化仪器厂）;水浴锅（DF-101SA，瑞力仪器设备源头厂家）;十万分之一天平（BS124S，北京赛多利斯仪器系统有限公司）;生物安全柜，（BSC-1500ⅡA2-X，济南圣科环保科技有限公司）;恒温恒湿培养箱（LHS-250HC-11，上海一恒科学仪器有限公司）;压力蒸汽灭菌器（MSG.N 180L，山东威高集团医用高分子制品股份有限公司）;数控超声波清洗器（KQ-100DE，昆山市超声仪器有限公司）;酶标仪（FC，Labsystems）;半径10 cm离心机（H-1600RW，西安超杰仪器设备有限公司）;倒置荧光显微镜（IX71，Olympus）;高压蒸气灭菌锅（CLG-40M，ALP）。

1.2 试剂

所用药材采于2013年西藏昌都地区的普尔那，由西藏自治区药材鉴定专家嘎务副教授鉴定。无水乙醇（C0691510226，南京试剂有限公司）;乙酸乙酯（141-78-6，南京试剂有限公司）;氯化钠（7647-14-5，南京试剂有限公司）;蒸馏水（7732-18-5，南京试剂有限公司）;琼脂粉（DE0010，北京拜尔迪生物科技有限公司）;蛋白胨（PO0262D，北京拜尔迪生物科技有限公司）;酵母提取物（CM0019，北京拜尔迪生物科技有限公司）;氯化钠（DE0008，北京拜尔迪生物科技有限公司）;磷酸盐缓冲液（Corning，北京拜尔迪生物科技有限公司），麦康凯琼脂培养基（M8560-250 g，Solarbio）;Gibco胎牛血清（FBS，北京拜尔迪生物科技有限公司）;DMEM培养液（SH30022.01B，黑龙江久丰生物工程有限公司）;二甲基亚砜（DMSO，北京化工厂）。

1.3 耐药菌株与细胞

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）临床分离株1902115号，由北京中医药大学东直门医院检验科细菌室提供。人肝癌细胞系HepG2细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞由中国科学院纳米科研中心提供。

2 方法与结果

2.1 普尔那不同部位待测样品的制备

取普尔纳的茎和叶的粉末加入80%乙醇进行超声提取，再分别用乙酸乙酯、无水乙醇溶剂进行萃取，用含DMSO的溶液配制成相应浓度的待测样品。

2.2 菌种活化及菌悬液制备

取储藏菌少许接种于麦康凯琼脂培养基，35℃培养18～24 h使菌种活化。用无菌生理盐水将MRSA菌液调整浓度为1×107、1×108 cfu/mL备用。

2.3 K-B纸片法

采用K-B纸片法分别测定不同浓度的普尔那茎或叶的无水乙醇提取物或乙酸乙酯提取物对MRSA抑菌环直径。所有无菌操作均在生物安全柜中规范进行。DMSO对MRSA抑菌圈直径为0 mm，无抑制作用。待测样品浓度相同，MRSA菌液浓度越高，抑菌环直径越小;MRSA菌液浓度相同，待测样品浓度越高，抑菌环直径越大。与其他待测样品浓度比较，普尔那叶无水乙醇提取物（100 mg/mL）对MRSA菌液（1×107 cfu/mL）抑菌活性最强（5.00 mm）。见表1。

2.4 比浊法

采用试管稀释法测定不同浓度普尔那叶无水乙醇提取物对MRSA的MIC值及MBC值。所有无菌操作均在生物安全柜中规范进行。普尔那叶无水乙醇提取物浓度为10.00、5.00 mg/mL时，肉眼观察试管内澄清，浓度为2.50 mg/mL时可见菌丝。浓度为1.25、0.63 mg/mL时浑浊。阴性对照组（空白培养基）澄清，阳性对照组（浓度为0.00 mg/mL）浑浊。随着药物浓度的增加，对MRSA菌液（1×107 cfu/mL）抑菌活性逐渐增强。见表2。

2.5 平板划线法

采用平板划线法测定不同浓度普尔那叶无水乙醇提取物对MRSA的MIC值及MBC值。所有无菌操作均在生物安全柜中规范进行。普尔那叶无水乙醇提取物浓度为10.00、5.00 mg/mL时，肉眼观察培养基相应区域内无菌生长。普尔那叶无水乙醇提取物浓度为2.50、1.25 mg/mL时，可见少量菌生长。普尔那叶无水乙醇提取物浓度为0.63 mg/mL时明显可见大量菌生长，阳性对照组明显可见大量菌生长。结果显示，普尔那叶无水乙醇提取物对MRSA菌液（1×107 cfu/mL）的MIC值为1.25 mg/mL，MBC值为5.00 mg/mL。见图1。

2.6 细胞株的培养及铺板

将人肝癌细胞系HepG2细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞培养在含10%胎牛血清，1%双抗DMEM的细胞培养液中，放置于37°C培养箱备用。计算出所需数量的细胞液，加入新鲜培养液稀释，3×103/孔的细胞数接种于96孔培养板中，将细胞培养板放置培养箱中培养24 h。

2.7 配药及给药

分别称取普尔那茎的待测样品，加入适量的DMSO配制成10 mg/mL的储备液。取出铺有细胞的96孔板，给药组每孔加入100 μL不同浓度的待测样品液，细胞对照组和空白对照组分别加入100 μL新鲜培养液，放置培养箱中培养72 h。

2.8 MTT法

待给药细胞培养72 h后，每孔加入MTT溶液，將细胞放置于培养箱中培养4 h后取出，加入150 μL/孔DMSO，用酶标仪测定490 nm下OD值，根据以下公式计算抑制率（%）。抑制率（%）=[1-（OD给药组-OD空白组）/（OD正常组-OD空白组）]×100%。高浓度普尔那叶-酯部位对人肝癌细胞系HepG2细胞表现出最佳的抑制活性（21.70±0.86）%;高浓度普尔那叶-酯部位对人宫颈癌细胞系HeLa细胞表现出最佳的抑制活性（41.90±0.18）%。见表3。

4 讨论

《蓝琉璃》记载了普尔那具有抗菌解毒、治肿块及疮瘍的功效[2]。Yin等[12]发现普尔那中香豆素具有抗耐药菌的作用;许凉凉[16]发现普尔那中挥发油具有抗菌抗炎的活性;Sun等[13]发现普尔那中提取的高车前素具有抑制血管再生及胰腺肿瘤的作用;还有研究发现普尔那中提取的冬凌草素为抗肿瘤物质[20]。然而，目前关于普尔那抗菌及抗肿瘤的研究报道仍较少。本研究选取MRSA、人肝癌细胞系HepG2细胞、人宫颈癌细胞系HeLa细胞作为研究对象，比较普尔那不同部位的不同提取物的抗耐药菌及抗肿瘤活性。结果显示，普尔那叶的无水乙醇提取物抗菌活性更好，普尔那叶的乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用较好，与传统普尔那的功效及现代药理研究结果相一致。对于普尔那叶无水乙醇提取物及乙酸乙酯提取物中活性成分的分离鉴定及分子机制有待进一步研究。

[参考文献]

[1]  中国科学院西北高原生物所.藏药志[M].青海：青海人民出版社，1996：205.

[2]  国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草·藏药卷[M].上海：上海科学技术出版社，2002.

[3]  帝玛尔·丹增彭措.晶珠本草[M].毛继祖，林鹏程，等译.上海：上海科学技术出版社，2012：144.

[4]  顿珠，米玛，陈静，等.高效液相色谱法测定藏药结血蒿中熊果酸含量[J].中国医药导报，2014，11（14）：96-98，101.

[5]  Tian SH，Wei HL， Zhao MB，et al.Sesquiterpenes from the aerial parts of Artemisia vestita wall [J]. J Chin Pharmaceutical Sci，2013，22（6）：527-530.

[6]  Tian SH，Chai XY，Zan K，et al. Three new eudesmane sesq-uiterpenes from Artemisia vestita [J]. Chin Chem Lett，2013，24（9）：797-800.

[7]  Chu SS，Liu QR，Liu ZL. Insecticidal activity and chemical composition of the essential oil of Artemisia vestita from China against Sitophilus zeamais [J]. Biochem Syst Ecol，2010，38（4）：489-492.

[8]  白银娟，李瑜，师彦平，等.毛莲蒿的化学成分[J].中国药学杂志，1997，32（8）：16-19.

[9]  Ahad S，Tanveer S，Nawchoo IA，et al. Anticoccidial activity of Artemisia vestita （Anthemideae，Asteraceae）-a traditional herb growing in the Western Himalayas，Kashmir，India [J]. Microb Pathog，2017，104：289-295.

[10]  Shamaila I，Haroon A，Muhammad M，et al. Anthelmintic activity of Artemisia vestita Wall ex DC. and Artemisia maritima L. against Haemonchus contortus from sheep [J]. Vet Parasitol，2015，212（3/4）：451-455.

[11]  王聚樂，周惠英，顿珠.藏药血结蒿对迟发型变态反应的影响[J].西藏医药杂志，2005，27（2）：56-58.

[12]  Yin Y，Gong FY，Wu XX，et al. Anti-inflammatory and immunosuppressive effect of flavones isolated from Artemisia vestita [J]. J Ethnopharmacol，2008，120（1）：1-6.

[13]  Sun Y，Wu XX，Yin Y，et al. Novel immunomodulatory properties of cirsilineol through selective inhibition of IFN-γ signaling in a murine model of inflammatory bowel disease [J]. Biochem Pharmacol，2010，79（2）：229-238.

[14]  彭莘媚，潘旭玲，闻轩，等.浅述香豆素类化合物的抗菌活性[J].化学试剂，2019，41（4）：371-377.

[15]  杨正明，滕云，韩亚涛，等.响应面法优化藏药毛莲蒿总香豆素的超声辅助提取工艺[J].西南师范大学学报：自然科学版，2016，41（6）：74-80.

[16]  许凉凉.藏药牙膏制备工艺及抑菌抗炎功效研究[D].北京：北京中医药大学，2015.

[17]  Lin CK，Kazmierczak BI. Inflammation：A Double-Edged Sword in the Response to Pseudomonas aeruginosa Infection [J]. J Innate Immun，2017，9（3）：250-261.

[18]  马书梅，刘瑞娟，张影影.肺癌的流行病学[J].世界最新医学信息文摘，2019，19（26）：77-78，80.

[19]  本刊编辑部，刘林.藏医药，从神秘走向现实[J].中国医药导报，2007，4（25）：16.

[20]  登巴达吉.略论藏药普尔芒的识别及应用[J].中国藏学，2014（2）：146-151.

（收稿日期：2019-12-24）