超声时间对大豆-乳清混合蛋白结构及乳化性质的影响

王喜波 王 琳 周国卫 乔金文 张安琪 王玉莹

(东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

大豆分离蛋白(Soy protein isolate, SPI)与乳清分离蛋白(Whey protein isolate, WPI)是人类最重要的食源蛋白质[1]。近年来，通过混合蛋白得到全新口感和更有利于人体健康的食品，特别是优质植物蛋白和优质动物蛋白的混合蛋白食品越来越受到重视[2]。混合体系具有互补作用，主要体现在大豆分离蛋白与乳清蛋白间可进行互相作用并形成“关键簇”，可以促进氨基酸的高效利用[3]。大豆蛋白是目前研究最多、且容易获得的植物蛋白之一，通常用作传统动物蛋白的部分替代品。然而，未经处理的大豆蛋白部分或全部替代牛乳蛋白会对食品质地和感官特性产生负面影响。

超声波技术被认为是提高蛋白质溶解性等功能特性的最佳方法[4]，超声波的空化作用与空穴效应能够破坏蛋白质的四级结构，使蛋白分子结构发生改变，小分子亚基或肽更多地暴露出来，进而改变蛋白质的功能特性。乳化性是混合蛋白加工过程中重要的功能指标，是决定混合蛋白在生产实践中应用的重要体现，也是影响混合蛋白产品品质稳定性的关键因素。提高乳化性有利于改进食品组织结构、口感和外观，可提高食品保存性[5]。研究发现，采用高强度超声处理可提高卵清蛋白[6]和小麦面筋蛋白[7]的乳化活性及乳化稳定性。CHEN等[8]研究发现，高强度超声波处理SPI，在400 W时会明显提升其乳化活性与乳化稳定性。ARZENI等[6]采用高强度超声处理卵清蛋白，乳液稳定性增加，热聚合变快。ZHANG等[9]采用超声技术对花生蛋白进行改性，结果显示，乳化活性与溶解性明显增大，分子结构发生改变。超声功率与超声时间处理都会影响蛋白的乳化特性，在一定范围内，由于超声功率的增大，乳化活性与乳化稳定性均会提高[10]。目前，关于超声处理对蛋白乳化特性及结构的影响已有部分研究，但超声处理对SPI-WPI混合蛋白体系结构及乳化特性的研究还鲜有报道。本课题组前期已研究了超声功率对SPI-WPI混合蛋白结构及理化性质的影响[11]，本文在此基础上进一步研究超声时间对混合蛋白结构及乳化特性的影响，分析混合蛋白乳化特性改善的机理，以期为研究新型高乳化性的双蛋白食品提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乳清分离蛋白，美国HILMAR公司，蛋白质量分数93.09%；十二烷基磺酸钠 (SDS)，Sigma公司；大豆分离蛋白，实验室自制，蛋白质量分数90.96%；低分子量蛋白质Marker，索莱宝生物科技有限公司；5×蛋白上样缓冲液，索莱宝生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-3600Plus型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；ULTRA-TURRAX T18 Basic 型高速分散机，德国 IKA 公司；FD5-series型冷冻干燥机，美国西盟国际集团；JY92-ⅡN型超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司； FTIR-8400S型傅里叶变换红外光谱仪，日本岛津公司；F-4500型荧光分光光度计，日本日立公司。

1.3 试验方法

1.3.1SPI-WPI混合蛋白制备

制备方法参照QIN等[12]的方法，分别将SPI和WPI溶于去离子水中，质量浓度为100 mg/mL，磁力搅拌器于室温 (20℃)下搅拌2 h，然后将两种蛋白按体积比1∶1进行混合并继续用磁力搅拌器搅拌2 h，使其充分溶解。对照组：分别将SPI和WPI溶于去离子水中，使蛋白质量浓度为100 mg/mL，在室温下搅拌4 h，使其充分溶解。4℃静置12 h。

1.3.2超声处理

参照HU等[13]的方法，将已制备好的SPI-WPI混合蛋白溶液、SPI与WPI溶液放置于50 mL离心管中。在超声处理前将盛有蛋白液的离心管放置于装满冰的烧杯中，在超声期间进行冰浴处理，使样品温度控制在25～35℃之间防止样品过热。将超声处理器的钛探头(直径0.636 cm)深入溶液1～2 cm，设置超声功率为300 W，超声时间分别为0、15、30、45 min，得到超声后的样品。

1.3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳

参考LAEMMLI[14]的方法并加以改进，配置5%的上层胶和13%的下层胶备用。将蛋白样品稀释为5 mg/mL，并与5×SDS上样缓冲液以体积比4∶1进行混合，沸水处理5 min。将冷却后的蛋白溶液吸取7 μL注入样孔。初始电压设定为90 V，进入下层胶时设定电压为120 V。电泳结束后将凝胶条用考马斯亮蓝染色液(R250)染色后静置12 h，之后用脱色液脱色3～4次，采用凝胶成像系统分析电泳条带。

1.3.4傅里叶红外光谱(FTIR)测定

将冷冻干燥后的蛋白样品与溴化钾按质量比为1∶100混合，用研钵磨成细小粉末，然后将混合后的粉末制成薄片[15]，再用傅里叶变换红外光谱仪在400～4 000 cm-1处作全波段扫描，分辨率为4 cm-1。扫描次数为 32。

1.3.5紫外扫描

参照MORALES等[16]的方法，将蛋白样品用pH值7.0的磷酸盐缓冲溶液 (PBS, 0.01 mol/L)进行稀释，使其质量浓度为2 mg/mL，用紫外可见分光光度计进行紫外扫描，设置波长范围220～400 nm，扫描速率为100 nm/min。试验值取3次扫描的平均值。

1.3.6表面疏水性测定

参照HASKARD等[17]的方法略作修改。用pH值7.0的PBS (0.01 mol/L) 对样品溶液进行稀释，使其样品质量浓度为4、1、0.25、0.062 5 mg/mL。加入20 μL的ANS (8-苯胺-1-萘磺酸，8 mmol/L，pH 值7.0) 荧光探针，混合后在室温下避光处理15 min。测定样品的荧光强度，其中设定发射波长为470 nm，激发波长为390 nm，狭缝宽度5 nm。将测得的荧光强度与蛋白溶液质量浓度制图并分析，其斜率作为蛋白质表面疏水性指数。

1.3.7浊度测定

参考MARTINI等[18]的方法，用pH值7.0的PBS (0.01 mol/L) 将样品稀释为5 mg/mL，将待测样品用分光光度计测定吸光度用以表征样品浊度，波长为600 nm。每个样本测定3次并取平均值。

1.3.8乳化活性及乳化稳定性测定

参照 PEARCE等[19]的方法。用pH 值7.0的PBS (0.2 mol/L) 将蛋白样品稀释至2 mg/mL，取6 mL蛋白样品溶液加入2 mL大豆油，用高速分散均质器于11 000 r/min搅打1 min后，立即于烧杯底部取样50 μL，加入到5 mL 0.1%的SDS溶液中，混匀后用分光光度计测定吸光度，波长为500 nm，以SDS溶液作为空白。样品室温放置10 min后再次取样测定吸光度。其乳化活性指数和乳化稳定性指数计算公式为

(1)

(2)

式中EAI——乳化活性指数，m2/g

ESI——乳化稳定性指数，min

T——常数，取2.303

N——稀释倍数，取100

φ——油相体积分数，取25%

L——比色池光径,cm

C——乳化液形成前蛋白溶液的浓度，mol/L

A0——乳状液在0 min的吸光度

A10——乳状液在10 min的吸光度

1.4 数据统计分析

每个试验重复3次，利用SPSS Statistics 20软件对数据进行统计分析，采用 Origin 9.0 软件对数据进行图谱处理。

2 结果与讨论

2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)图谱

图1为经不同超声时间处理的SPI、WPI和SPI-WPI的凝胶电泳图。图中，泳道M表示标准分子量；泳道1、2、3、4分别为SPI样品0、15、30、45 min超声处理；泳道5、6、7、8分别为WPI样品0、15、30、45 min超声处理；泳道9、10、11、12分别为SPI-WPI样品0、15、30、45 min超声处理。由图可知，与未处理的蛋白相比，超声处理后蛋白条带没有发生明显变化，说明没有新的蛋白质降解片段或蛋白质聚集产物出现，超声处理不会引起蛋白质分子量的改变[20]。SPI-WPI混合体系与对照SPI和对照WPI相比在66.2 ku以上有新条带出现，可能是因为混合蛋白在超声处理时产生的热效应促使SPI与WPI之间进行相互作用，形成新的蛋白聚集体。

图1 不同超声时间处理下SPI、WPI、SPI-WPI的 SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE of SPI, WPI and SPI-WPI under different ultrasonic time

2.2 傅里叶红外光谱分析

图2为不同超声时间处理后SPI、WPI、SPI-WPI的傅里叶红外光谱图。蛋白质二级结构主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲，氢键是稳定蛋白质二级结构的主要作用力。

表1为拟合后SPI、WPI、SPI-WPI二级结构含量。由表可知，未处理蛋白二级结构中β-折叠含量最高，其次为β-转角、无规则卷曲和α-螺旋。随超声时间增加，SPI和WPI二级结构中，β-折叠含量逐渐降低，β-转角含量显著增加，α-螺旋和无规则卷曲含量略有增加。SPI-WPI中α-螺旋和β-折叠含量降低，β-转角含量增加，无规则卷曲含量略有增加。β-折叠含量降低可能是由于超声引起的空穴效应促进蛋白质的机械运动，使分子相互撞击，促使蛋白质发生聚集反应。STATHOPULOS等[22]也指出蛋白质发生聚集会导致β-折叠含量减少。β-折叠含量还与蛋白质的疏水相互作用有关，其含量降低表明蛋白质疏水基团的暴露，疏水性增强[23]。而同作为β结构，β-折叠更易转变为β-转角，在超声处理下β-转角含量增加，也可以说明超声波处理使蛋白质结构更加舒展[24]。此外，经超声处理后SPI-WPI中无规则卷曲含量增加伴随着α-螺旋含量的降低，说明超声处理可以改变WPI和SPI的内部结构，并且会促进混合蛋白质之间的相互作用[25]。

图2 不同超声时间处理对傅里叶红外光谱的影响Fig.2 Effects of different ultrasonic time processing on FTIR spectra

表1 不同超声时间处理下SPI-WPI、SPI和WPI二级结构相对含量Tab.1 Effect of different ultrasonic time processing on the secondary structure analysis of SPI-WPI, SPI and WPI

2.3 紫外光谱分析

超声处理SPI-WPI、SPI与WPI发出不同紫外吸收峰的原因是两种蛋白质侧链含有不同的酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸残基[26]。样品的紫外吸收光谱不同，可推断蛋白质分子三级构象发生改变[27]，进而分析氨基酸残基的改变[28]。

不同超声时间处理蛋白体系紫外光谱图如图3所示。由图可知，不同时间超声处理后SPI-WPI混合蛋白体系的紫外光谱强度大于SPI和WPI，说明超声处理对混合蛋白作用效果更明显，混合体系在30、45 min处理后紫外强度显著增加，且最大吸收强度略微红移，表明氨基酸环境向更加疏水的环境转移，这可能是因为混合蛋白体系构象发生了改变，超声使蛋白结构变得更加舒展。SPI与WPI在超声处理后，紫外强度略微增加，说明超声处理使SPI与WPI蛋白内部结构部分展开，发色基团与芳杂环疏水基团更加暴露。SPI紫外强度变化较小的原因可能是其蛋白颗粒较大，超声处理后体系易发生聚集体，会影响发色基团的暴露。混合体系紫外强度的变化说明不同超声时间处理有利于混合蛋白体系构象发生变化，引起蛋白质微观结构的改变。

图3 紫外光谱图Fig.3 Ultraviolet spectrum

2.4 表面疏水性

不同超声时间处理对蛋白质表面疏水性的影响如图4所示。实验结果以平均值±标准偏差表示，图中不同大、小写字母表示具有显著性差异(p<0.05)，下同。由图可知，未处理的SPI-WPI混合体系、SPI与WPI样品表面疏水性最低。经处理后的混合体系和SPI表面疏水性呈先增大后下降的趋势，SPI-WPI混合体系增加最为显著，在超声30 min时达到最高，WPI表面疏水性随着超声时间的延长持续增大。这可能是因为未经超声处理的蛋白中疏水基团被包裹在蛋白分子内部，导致其与荧光探针的接触受到抑制[29]。超声处理产生的空穴效应使蛋白氢键和分子间作用力裂解，蛋白质分子结构发生变化，聚集的球状蛋白质逐渐解缔，蛋白质分子进一步展开[30]，隐藏在SPI-WPI混合蛋白与SPI蛋白体系内部疏水基团与发色基团在长时间超声处理后更多地暴露出来，蛋白结构变得更加舒展。在较长时间(45 min)超声处理后，蛋白体系表面疏水性又降低，可能是因为长时间超声处理产生了热效应，在后期冷却过程中疏水互相作用会造成蛋白质疏水聚集，从而表面疏水性指数减小。

图4 不同超声时间处理对蛋白质表面疏水性的影响Fig.4 Effect of different ultrasonic time processing on hydrophobicity of protein surface

2.5 浊度分析

图5为不同超声时间处理对蛋白质浊度的影响。随着超声时间的增加，SPI、WPI、SPI-WPI混合体系浊度均呈下降趋势。未处理样品的浊度最高，这是由此时的复合体系蛋白分布不均衡且颗粒较大导致。SPI和SPI-WPI在0～15 min处理下浊度变化最显著。这可能是因为此时超声处理复合体系间蛋白碰撞面大，空穴效应使大分子物质分解为小分子颗粒，样品中颗粒大小和颗粒数目发生变化，CROMWELL等[31]也认为样品浊度与其溶液中聚集体数量和大小有关。超声45 min时浊度达到最小值。SPI-WPI混合体系浊度在超声处理30～45 min时间内变化不明显。这可能是因为随着超声时间继续延长，体系中悬浮颗粒的粒度尺寸减小，此时体系的布朗运动快速增加，蛋白颗粒接触几率增大发生重聚集，从而使颗粒更难减小。浊度也与胶体的大小、浓度和折射率性质等高度相关[32]。WPI浊度变化不显著，是因为乳清蛋白有很好的分散性，且粒子较小。

图5 不同超声时间对浊度的影响Fig.5 Effect of different ultrasonic time on turbidity

2.6 乳化活性及乳化稳定性分析

图6 不同超声时间对乳化性的影响Fig.6 Effect of different ultrasonic time on emulsification

图6为不同超声时间处理SPI-WPI、SPI、WPI对其乳化活性及乳化稳定性的影响。由图可知，SPI-WPI的乳化活性与乳化稳定性随超声处理时间的增加呈现先上升后下降的趋势，在超声30 min时乳化活性指数达到最大值(78.39 m2/g)，乳化稳定性指数同时达到最大值(17.31 min)。SPI与WPI的乳化活性也有同样的趋势，在30 min达到最大值，乳化活性指数分别为66.78、77.47 m2/g。乳化活性升高可能是因为表面疏水性增加，界面张力降低，蛋白质和油脂之间的相互作用增加[33]。超声30 min后SPI-WPI、SPI、WPI的乳化活性随超声时间增加逐渐下降，这可能是因为超声处理蛋白时，颗粒的破碎与重聚集同时发生，随着超声作用时间的延长，蛋白之间重聚集现象出现，影响疏水基团的暴露，从而导致乳化活性在一定程度上下降[34]。SPI的乳化稳定性指数在15 min时达到最大值(12.61 min)。WPI的乳化稳定性指数则在45 min达到最大值(16.92 min)。超声处理作用会带来空化效应和机械效应，这种作用力会打破蛋白质的四级结构，暴露更多的亚基。SPI-WPI混合体系的乳化活性及乳化稳定性略高于对照组，这可能是因为超声处理后SPI-WPI混合体系在水中进一步伸展，内部基团暴露，整体结构舒展利于两种蛋白之间相互作用[35]，同时增强蛋白的界面性质与疏水性质，直接导致乳化活性指数与乳化稳定性指数的升高[36]。

3 结束语

超声处理对混合蛋白的分子量无明显影响，但对二级、三级结构影响显著。随超声处理时间的增加，SPI-WPI混合体系中α-螺旋和β-折叠含量降低、β-转角含量和无规则卷曲含量增加，说明超声引起的空穴效应能促进蛋白质的机械运动，使分子相互撞击，促使蛋白质发生聚集反应，超声处理改变了WPI和SPI的内部结构，促进混合蛋白质之间的相互作用。紫外光谱结果显示，SPI-WPI紫外最大吸收峰发生轻微红移，且紫外光谱强度发生改变，说明超声处理改变了蛋白内部结构。随着超声时间的增加，SPI-WPI混合体系的浊度呈显著下降趋势，未处理样品的浊度最高，这是由此时的复合体系蛋白分布不均衡所导致。随着超声处理时间的增加，混合蛋白体系乳化活性指数与乳化稳定性指数呈现先增加、后下降的趋势，表面疏水性也有相同变化趋势。不同超声时间处理会改变蛋白结构，蛋白体系内部疏水基团与发色基团更多暴露，蛋白结构变得更加舒展。表面疏水性增加，增大了蛋白质和油脂之间的相互作用，有利于提高混合蛋白体系的乳化活性。