CRISPR/Cas9技术的研究进展及其在肺癌研究中的应用

朱奕骋

真核细胞基因组包含数十亿个DNA 碱基，其编辑十分困难。对基因组进行操作的技术突破之一，是通过同源重组（HR）进行基因靶向的开发。HR 介导的靶向技术通过操纵生殖系感受态干细胞，促进了敲入和敲除动物模型的产生，从而极大地推动了生物学研究的许多领域的发展。

基于核酸酶的基因编辑技术十分有潜力。其中的CRISPR/Cas9 技术，几乎可以靶向任何基因，且操作较为简便，敲除效率较高。本文简介了CRISPR/Cas9 技术的原理及其研究进展，并讨论了其在肺癌研究中的应用。

1 CRISPR/Cas9 技术概述

CRISPR/Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas9）是一种较为新颖的基因编辑技术，在科研领域及医疗领域有着十分广泛的应用。

1.1 CRISPR/Cas9 技术的产生背景

CRISPR/Cas9 技术可能是基因编辑领域近10 年来最伟大的成果之一。1987 年，日本的科学家发现了微生物中的串联间隔重复序列，但他们的报道并没有引起科学界的重视。

2002 年，Jansen 等这种序列其命名为CRISPR。此外，研究表明，局部DNA 双链断裂（DSB）可以触发易出错的非同源末端连接（NHEJ）修复途径。这些早期的基因组编辑研究，让DSB 诱导的HR 和NHEJ 成为真核生物基因组修饰的重要方法[1]。

2005 年，在科学家对分隔单个直接重复序列的间隔子序列进行分析的时候，他们发现，这些序列可能与噬菌体相关。他们推测，CRISPR 可能与微生物的免疫记忆和防御机制相关，不过，科学家仍未弄清，间隔子是如何发挥作用的。他们提出了一些假设，认为CRISPR 间隔子可能充当小RNA 向导，以降解的病毒转录物[2]。

2008 年，科学家又发现细菌CRISPR 系统能阻止外源DNA 的入侵，并验证了其功能[3]。

可以说，CRISPR 的发展主要经历了以下阶段（图1）：

图1 CRISPR-Cas9 基因编辑技术的发展阶段

1.2 CRISPR 系统

CRISPR 系统包括一系列Cas 蛋白，这些蛋白可以协助CRISPR 系统，使其更好地发挥免疫作用。在噬菌体入侵细菌时，Cas 蛋白将其识别，并整合到宿主的基因组上。在噬菌体第二次入侵时，CRISPR系统可以准确地识别外源噬菌体，并利用Cas 蛋白的内切酶活性切断其DNA，使外源噬菌体失去毒力（图2）。

图2 CRISPR-Cas9技术的操作示意图

1.3 CRISPR/Cas9 技术的应用

利用基因工程技术，我们可以改变细胞的遗传和表观遗传特征，从而开展基础生物学研究和医学研究。利用基因编辑技术，我们可以在动物或细胞模型中快速有效地诱导变异，从而改变其动物或细胞的功能。基因编辑也会促进有用的合成材料的生产，例如，硅基硅藻可以用于递送口服药物。此外，对农作物进行精确的基因编辑，可以提高其或病原体感染的抗性，提高食品的安全性。在医药领域，基因编辑可以弥补体细胞中的遗传或表观遗传缺陷，根治遗传病，这就是基因手术。最后，运用基因编辑技术改造细胞，可以让细菌高效地生产药物前体，显著降低治疗的成本[4]。

CRISPR/Cas9 技术在肿瘤的治疗中扮演着重要的角色。与其他肿瘤相比，肺癌的发病率和死亡率十分惊人。利用CRISPR/Cas9 技术，我们可以研究某些基因在肺癌的发生中的作用（图3），助力肺癌的诊断与治疗。

图3 CRISPR/Cas9技术治疗肺癌的流程图

2 CRISPR/Cas9 技术的原理

CRISPR/Cas9 技术的基本原理是，改造天然的Cas 蛋白，从而构建一个更稳定的核酸内切酶，让它在特定位置切断双链DNA，在DNA的修复的过程中，基因会发生突变，利用这个过程，科学家可以对基因进行定点改造。

在运用CRISPR/Cas9 技术对基因进行编辑时，必须首先将Cas9 核酸酶蛋白和gRNA 输送到靶细胞中。这通常是通过向受体细胞中转染表达DNA 的质粒来实现的，但我们也可以通过递送RNA 达到这一目的。gRNA 会将Cas9 引导至与gRNA 中的“间隔”序列匹配的靶DNA“原间隔子”序列处[5]。在原间隔子的旁边，通常存在一段原间隔物相邻基序（PAM），对于最常用的Cas9 蛋白，这段序列为NGG。如果间隔子和原间隔子相同，或在间隔子的5'末端仅有几个错配，Cas9 将切割两条DNA 链，造成双链断裂（图4）。

图4 CRISPR/Cas9技术的原理

3 CRISPR/Cas9 技术的研究进展

CRISPR 系统由sgRNA 和Cas 蛋白组成。在sgRNA 的指导下，Cas 蛋白定位到基因组的目标位置，从而实现精确的遗传修饰。修复DSB 的DNA 修复机制有两种高度保守的途径：NHEJ 和HR。NHEJ 是易于出错的修复机制，因为修复后的DNA 通常在靶位点周围有一个小的插入缺失，从而导致基因破坏。因此，我们通常利用NHEJ 使致病基因失活，改变其表达水平。相反，HR 是一种特定的DNA 修复机制，在存在修复模板的情况下，HR 将纠正基因突变或帮助我们插入合成序列。目前，CRISPR/Cas 系统已用于基因敲除、基因突变、转录激活和基因筛选等[6]。

许多科学家致力于对脱靶效应的研究，他们尝试改进Cas9，从而减少脱靶事件的发生。一些研究人员发现，产生单链断裂（SSB）可能是一种有效的方式。由于DNA 单链断裂是通过高保真碱基切除修复（BER）途径修复的，Cas9 切口酶可用于更特异性的NHEJ 和HR。

为了提高靶标DSB 的特异性，可以使用类似于二聚ZFN 或TALEN 的双切口法，来增加在靶DNA 中特异性识别的碱基总数。除双切口策略外，被人为截短的sgRNA，也会显著提高SpCas9 的靶向特异性，这可能是因为它们对错配更加敏感。我们可以在使用多重切口策略的同时应用这些截短的sgRNA，以进一步降低脱靶的概率。

4 CRISPR/Cas9 技术在肺癌研究中的应用

在过去的几十年中，基因疗法是癌症研究中最热门的领域之一。这是因为，癌症的发生与进展，与遗传有着密切的关系。与传统的治疗方法相比，基因疗法可以更彻底地治疗癌症，而且其副作用很小。使用CRISPR/Cas9 系统对内源基因座进行靶向修饰，可以克服传统方法的局限性。这一技术的不断成熟，使研究人员能够进一步探索癌症研究中的未知领域，为无数肿瘤患者带来了福音。

4.1 CRISPR/Cas9 技术在构建肺癌动物模型中的应用

构建肺癌动物模型一直是一项艰巨的任务，与CRISPR 相关的新技术浪潮，使研究人员能够构建更多满足研究需要的动物模型。将一些抑癌基因敲除，可能有助于构建在功能和结构上类似于天然肿瘤的肺癌动物模型。利用CRISPR/Cas9 技术，可以高效地敲除感兴趣的基因，从而构建相关的动物模型。一些科学家应用CRISPR/Cas9 技术敲除了3 种主要的肿瘤抑制基因TRP53、PTEN 和VHL，成功地构建了肺癌模型。在对某些肺癌相关基因的研究过程中，我们也可以将CRISPR/Cas9 技术与其他基因编辑技术结合使用[7]。

4.2 CRISPR/Cas9 技术在肺癌治疗中的应用

迄今为止，全世界有13 项将CRISPR 作为癌症治疗的干预手段的临床试验（来源：clinicaltrials.gov）。在离体基因编辑研究中，可以通过敲除T 淋巴细胞中某些降低其靶向效率的基因，来提高T 细胞的有效性；也可以将癌细胞抗原特异的嵌合抗原受体连接到T 淋巴细胞表面，以增加其靶向特异性，从而提高其靶向效率。

到目前为止，CRISPR/Cas9 技术作为肺癌的干预手段，仅在一项临床试验中得以实施。该试验目前正在四川大学进行。在这项试验中，研究人员评估PD-1 基因敲除的T 细胞治疗转移性非小细胞肺癌的安全性（试验编号：NCT02793856）。这项研究的基础是PD-1 基因的功能，PD-1 基因是一种促进程序性细胞死亡的基因，已被证明仅在活化的T 细胞中表达，并作为免疫检查点。因此，敲除PD-1基因将延长T 细胞的寿命，并通过破坏T 细胞周期检查点抑制剂来防止活化的T 细胞死亡。这将增加血液中活化的T 细胞计数，从而抑制肿瘤的进展。在上述研究中，研究人员从外周血中收集自体来源的T 细胞，并使用CRISPR/Cas9 系统特异性地敲除PD-1 基因。实现这一目标后，研究人员将进一步扩增并选择自体来源的PD-1 基因敲除的T 淋巴细胞。将这些T 细胞分批回输体内后，研究人员将评估治疗效果[8]。

5 结语

基于基因疗法的技术有可能在癌症研究中带来突破，而CRISPR 是一种非常有针对性和有效的工具，有潜力将其转化为可用的疗法。事实证明，与ZFN 和TALENs 等其他著名的基因治疗技术相比，CRISPR 具有许多优势。虽然现在可用的其他治疗方法只是暂时的，随着时间的流逝会逐渐消失，但是基因治疗是遗传的，可以永久使用，就像将治疗方法硬编码到体内一样。这具有创造疫苗和永久治愈的潜力。除治疗方面的应用外，CRISPR 也是了解我们细胞中代谢反应及信号通路的一种重要工具。我们应当充分利用CRISPR/Cas9 技术，更深入地研究与肺癌相关基因的功能，助力肿瘤治疗学的发展。