响应曲面优化食品接触用纸中异噻唑啉酮类杀菌剂残留量的测定条件

郑学殷　黄嘉乐　许志彬　李瑞玲　曾广丰

摘      要：建立了超高效液相色譜-串联质谱法对食品接触用纸和纸板中异噻唑啉酮类杀菌剂含量进行快速测定。样品用甲醇重复提取后，旋转蒸发浓缩，甲醇复溶，同时以回收率为指标，结合响应曲面分析优化前处参数。以流动注射方式优化5种异噻唑啉酮类化合物的质谱参数，以电喷雾离子源正离子模式电离，结合多反应监测模式进行测定。5种异噻唑啉酮类化合物在5.0～200 μg·L^-1范围内标准曲线线性良好，相关系数r均大于0.998 9，平均回收率为82.1%～95.2%，方法检出限为5.0～10.0 μg·kg^-1，方法定量限为15.0～35.0 μg·kg^-1，相对标准偏差RSDs为5.15%～6.49%。该方法简单高效、回收率高、灵敏度高和重现性好均能达到分析测定要求，可用于食品接触用纸和纸板中异噻唑啉酮类杀菌剂的测定。

关  键  词：超高效液相色谱-串联质谱;食品接触用纸和纸板;异噻唑啉酮;杀菌剂;响应曲面优化

中图分类号：O657.63; TS762.6      文献标识码： A      文章编号： 1671-0460（2020）06-1253-05

Optimization of Determination Conditions of Isothiazolinone Fungicides Residues in Food Contact Paper by Response Surface Methodology

ZHENG Xue-yin¹， HUANG Jia-le¹， XU Zhi-bin¹， LI Rui-ling²， ZENG Guang-feng³

（1. National Quality Testing Center for Processed Food （Guangdong）， Guangzhou Inspection and Testing Certification Group Company， Guangzhou Guangdong 511447， China;

2. SGS-CSTC Standards Technical Services Co.， Ltd.， Guangzhou Guangdong 510000， China;

3. Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center， Guangzhou Guangdong 510623， China）

Abstract： A method for determination of isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Samples were extracted by methanol repeatedly， then rotary evaporation was carried out to concentrate the samples， finally the samples were redissolved by methanol. The recovery rate was used as an indicator to optimize the pre-processing parameters with the response surface analysis. The mass spectrometry parameters of five isothiazolinone compounds were optimized by flow injection under positive mode of the electron spray ionization （ESI +） ， data of the analytes were obtained with mass spectrometric multiple reaction monitoring （MRM） mode. Five isothiazolinone compounds exhibited good linearity with correlation coefficient（r>0.998 9） when the concentrations ranged from 5.0 to 200 μg/L. The average recoveries of three spike levels were 82.1%～95.2%， while the limits of detection and the limits of quantitation were ranged 5.0～10.0 μg·kg^-1 and 15.0～35.0 μg·kg^-1， respectively. The relative standard deviations （RSDs） were ranged 5.15%～6.49%. This method is easy to operate， and its recovery， sensitivity and reproducibility could achieve the requirements of determination for isothiazolinone fungicides in food contact paper and cardboard.

Key words： Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; Food contact paper and cardboard; Isothiazolinone; Fungicide; Response surface methodology

異噻唑啉酮类杀菌剂是一种高效的广谱杀菌剂，对细菌、真菌及藻类等具有很强的抑制和杀灭作用^[1-2]，由于其具有低毒，高效、广泛杀菌等特点，所以被优良的杀菌剂应用于农业、工业等生产领域的防霉防腐^[3]。但在工业生产的同时，环境的污染问题也成为首要关注的问题。由于其优越性，在工业生产的过程中也很容易出现滥用的情况，由于大量的排放，导致了水体中的残留^[4-5]。近年有研究报道显示，异噻唑啉酮类杀菌剂对人体皮肤会有过敏作用和炎症效应^[6-8]，对于食品接触用纸的生产工业，若出现滥用的情况，对食品安全和消费者的人身健康有可能会造成重大的威胁。

目前对于异噻唑啉酮类杀菌剂的检测方法主要为高效液相色谱法^[9]、气相色谱法^[10]、气相色谱-质谱联用法^[11-13]和液相色谱-串联质谱法^{[5，14，15]}。液相色谱法和气相色谱法检测成本较低，但仪器选择性低，检出限高，分析时间长，杂质较多，影响分析结果。气相色谱-质谱联用法和液相色谱-串联质谱法利用四极杆对目标物进行筛选分离，能大大降低杂质对分析结果的影响，同时，检出限较低，对于监管产品安全问题，具有更广泛的应用。本文建立了超高效液相色谱-串联质谱法对5种异噻唑啉酮类杀菌剂的残留量进行同时测定，经方法学的数据分析，本方法回收率高，灵敏度高，重现性好，适合在日常检验中应用，同时，采用响应曲面优化设计^[16]，对测定条件进行优化，可应用于化工生产过程中的有毒有害物的监控。

1  实验部分

1.1  仪器与设备

高效液相色谱-质谱/质谱联用仪，配有电喷雾电离源（ESI）和MRM模式（4000Q，AB SCIEX公司）;电子天平;旋转蒸发仪;离心机，最大转速为10 000 r/min;超声波清洗器;涡旋混匀器。

1.2  材料与试剂

食品接触用纸和纸板样品（购自广州市批发市场）;甲酸（色谱纯，Aladdin）;甲醇、乙腈（HPLC，购自赛默飞世尔公司）;标准对照品：5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮、4，5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮、2-甲基异噻唑啉-3-酮、1，2-苯并异噻唑啉-3-酮、2-辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DR，购自安谱公司，纯度均为≥98%）。

1.3  实验条件

1.3.1  标准溶液的配制

基质空白溶液：用5种异噻唑啉酮呈阴性的样品进行前处理，得到的溶液即为基质空白溶液。

标准储备溶液：称取适量标准品于棕色容量瓶中，加入少量甲醇超声溶解，并用甲醇稀释至刻度线，得到标准储备溶液，质量浓度为1 mg·mL^-1。该储备溶液于2～8 ℃下避光保存。

混合标准工作溶液：分别准确移取一定体积的每种标准储备液，分别用甲醇和基质空白溶液重新定容成适当浓度为5，10，20，50，100，200 ?g·L^-1的混合标准工作曲线，曲线分别为溶剂曲线和基质曲线，于4 ℃下避光保存。

1.3.2  样品前处理

将食品包装纸或纸板剪成0.3 cm²大小的碎片，称取1 g （精确到0.01 g） 试样置于具塞离心管中，加入10 mL 甲醇，超声提取15 min。以10 000 r·min^-1 离心5 min，提取液倒入干净的旋转蒸发瓶，重复提取一次，提取液倒入同一个的旋转蒸发瓶。旋转蒸发溶剂近干，用2 mL甲醇定容，过0.22 μm 微孔滤膜后供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.4  仪器条件

1.4.1  色谱条件

色谱柱：Waters BEH C₁₈ （100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）;柱温为35 ℃;进样量为5 μL;流动相A为甲醇，B为0.1%甲酸水溶液（体积分数），流速为0.5 mL·min^-1;采用梯度洗脱程序淋洗：0～3.0 min，50% A;3.0～5.0 min，50%～95% A;5.0～8.5 min，95% A;8.6～12.0 min，50% A;8.6～12.0 min，50% A。

1.4.2  质谱条件

LC-MS/MS 扫描方式：电喷雾电离源（ESI+）;气帘气：25 psi;电离电压（IS）：4 500 V;离子源温度（TEM）：550 ℃;雾化气（GAS1）：50 psi;加热辅助气（GAS2）：50 psi;碰撞气（CAD）：medium;采集模式：多反应监测（MRM）模式。

1.5  响应曲面设计

实验基于优化后的甲醇用量，结合提取次数和超声时间，设计响应曲面实验，Box Behnken设计模型来设计提取因素条件，以提取次数（X₁），超声时间（X₂， min），溶剂用量（X₃， mL） 三个因素为计变量，实验水平范围见表1。

2  结果与分析

2.1  质谱参数的优化

由于5种异噻唑啉酮化合物均含有N原子，具有一定的电负性，在电喷雾正离子模式下更容易形成[M+H]⁺的准分子离子峰，且丰度较高，因此选用正离子模式进行测定。以流动注射的方式将标准溶液注入离子源，并以正离子模式对母离子进行扫描，确定母离子质荷比后，进行母离子的二级碎片扫描，选择响应值较高的两个碎片作为定量和定性离子，最后通过（multiple reaction monitoring， MRM）模式分别对各个碎片的去簇电压（declustering potential， DP）和碰撞电压（collision energy， CE）进行优化，使各个碎片能达到较好的灵敏度。详细见表2。5种异噻唑啉酮提取离子流色谱图见图1。

2.2  提取溶剂的选择

在实验前期对提取溶剂的选择做了初步的选择，由于5种异噻唑啉酮化合物具有一定的极性，因此选择极性较大的溶剂有利于回收率的提高，最终选择了甲醇和乙腈作为提取溶剂，并在提取两次合并的情况下，以5种异噻唑啉酮的平均回收率作为考察依据，分别考察了甲醇和乙腈用量对回收率的影响，结果表明，在同等用量的情况下，甲醇作为提取溶剂，回收率更高，同时当甲醇用量达到10 mL时，5种异噻唑啉酮回收率达到了分析要求，而用量上升时，回收率差异不明显，考虑到旋转蒸发的时间和耗材成本，最终选取10 mL甲醇提取两次合并作为前处理条件，详细结果见图2。5种异噻唑啉酮在此条件下的回收率见图3。

2.3  基质效应

由于前处理方法采用甲醇直接提取，因此，提取液中杂质较多，在质谱中有可能存在基质效应从而影响目标物离子化程度，所以对5种异噻唑啉酮的基质效应程度进行了探究。

用基质空白溶液配制单点混合标准液，计算得出的回收率K值。若基质效应不明显，则此回收率应为90%～110%之间。而单点基质混合标准中5种异噻唑啉酮的K值在为53%～73%，该前处理方法对5种异噻唑啉酮的分析具有较明显的基质效应，采用基质曲线进行计算校正后，回收率达到日常检验的要求。

2.4  响应曲面优化设计

为了优化5种异噻唑啉酮的最佳提取条件，采用Box Behnken响应曲面设计优化提取次数（X₁），超声时间（X₂，≠min），溶剂用量（X₃，≠mL）等3个提取条件。实验选择回收率较低的2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮为代表分析对象，采用ANOVA方差分析对数据结果进行分析评价，结果详见表3。

分析结果显示，提取次数、超声时间和溶剂用量的一次因素（检验P值为0.000 1、0.002 2和0.001 0）和提取次数的二次因素（检验P值为0.000 1）为显著影响因素，缺省验证实验的P值为0.507 5，模型的P值为0.000 1，显示显著水平。根据系统推荐的二次方程进行拟合，得到2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮的拟合曲线预测方程为（1），拟合相关系数R²为0.976 3。

y =89.30+6.58X₁+2.49X₂+2.86X₃+1.50X₁X₂+1.45X₁X₃+0.77X₂X₃-5.96X₁²-1.54X₂²-0.44X₃²。（1）

對实验结果进行分析后，以2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮代表分析物的回收率为基础，进行模型建立与预测，得到各个因素相应的三维立体图（图4），能更直观地分析相对较佳组合。结合检测成本等因素考虑，最终选取提取条件为提取次数2次，超声时间15 min，甲醇用量10 mL作为提取条件。在此因素水平组合下，5种异噻唑啉酮类杀菌剂均获得较好的平均回收率。

2.5  方法的线性范围和检出限

在本方法所确定的实验条件下，用基质空白将混合标准溶液稀释至5、10、20、50、100、200 ?g·L^-1进行测定，以峰面积和浓度进行标准曲线绘制，结果表明，拟合曲线线性良好（见表4），相关系数均大于0.998 9，方法的检出限和定量限分别为5.0～10.0和15.0～35.0 μg·kg^-1，表明方法的灵敏度较好，可应用于日常检测。

2.6  回收率与精密度实验

对市售的产品进行批量测定，为方便加标水平的确定，选取阴性的样品进行标准添加试验，按照5种异噻唑啉酮最大定量限的1倍、2倍和5倍三个水平进行添加，并对每一水平平行测定6次，计算日内相对标准偏差，以考察实验重复性。测定结果为平均回收率在82.1%～95.2%之间，相对标准偏差RSD为5.15%～6.49%。

结果表明，经基质曲线校正和响应曲面优化后的回收率能达到分析测定的要求，且精密度也较高，说明实验重复性较好。详细结果如表5所示。