植物乳酸菌高密度发酵培养基优化

刘利利 周勇 卢宗梅

摘      要：主要探索了如何提高植物乳杆菌高密度发酵活菌数，研究了培养基成分、pH值等发酵条件。结果表明：植物乳酸菌生长最适碳源是淀粉、葡萄糖，最适氮源是酵母浸粉;二价锰离子和无机盐对菌体的生长有促进作用;最适培养基组成：酵母浸粉3%，醋酸钠0.5 %，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾0.3%，氯化钠0.2%，吐温80 0.1%，硫酸锰0.3‰，硫酸镁0.2‰，无水葡萄糖2.2%，碳酸钙0.5%，淀粉4.4%。在5 L半自动发酵罐中，发酵16 h左右，活菌数为8.9×1011 CFU/mL，发酵液保存周期较长，在75 d跟踪检测中活菌数无数量级变化。

关  键  词：植物乳酸菌;培养基组分;活菌数;保存周期

中图分类号：Q 815      文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）04-0616-04

Abstract： How to increase the number of viable bacteria in high-density fermentation of lactobacillus plantarum was mainly explored， and the fermentation conditions were studied，such as medium composition and pH value. The results showed that the mixture of starch and glucose was the optimum carbon source for the growth of lactic acid bacteria， while yeast extract was the optimum nitrogen source;Divalent manganese ions and inorganic salts could promote the growth of bacteria;the optimum medium composition was as follows： yeast extract 3%， sodium acetate 0.5%， triammonium citrate 0.2%， dipotassium phosphate 0.3%， sodium chloride 0.2%， Tween80 0.1%， manganese sulfate 0.3‰，magnesium sulfate 0.2teanhydrous glucose 2.2%，calcium carbonate 0.5%，starch 4.4%. The number of viable bacteria reached 8.9che11 CFU/mL after 16-hour fermentation in a 5 L semi-automatic fermentation tank，and the change of number of viable bacteria in the fermentation broth was not more than one magnitude order after 75-day storage.

Key words： Plant lactobacillus; Medium composition; Number of living bacterium; Preservation period

植物乳酸菌（LacLo ba-cillus planlarum）具备免疫调节、抑制病原微生物、维持肠道菌群平衡和促进营养物质吸收等很多保健作用，同时也广泛应用于微生物制剂[1]。植物乳酸菌可以抑制肠道中有害菌体的繁殖，保持肠道中较多数量有益菌的生长，可改变肠道蠕动，保持健康的身体。而植物乳酸菌在肠道中可以制造人体所需的维生素VK、VB6、VB12、RIBOFLAVIN、叶酸等，同时可以抑制破坏维生素B1酵素，使肠道内维生素B族保持稳定。在动物肠道内生长代谢，可以转变多种营养成分，如氨基酸、维生素、营养因子等，参与动物肠道中的有益菌生长，为微生物提供良好的环境[2]。乳酸菌是饲料添加剂中四大类微生物之一。

微生物自身的生长、繁殖以及代谢产物的累积离不开各种营养成分，在生长过程中需要提供一定的碳源、氮源、营养因子以及金属离子等。碳源有利于微生物进行呼吸作用，氮源利于菌体蛋白的合成、核酸的生成。高密度培养是采用基础培养基MRS，根據菌体生长环境进行培养基优化，在一定pH条件下进行摇瓶试验，益生菌含量优于基础培养基，再利用5 L发酵罐验证其发酵效果，跟踪发酵液保存周期，从而对饲料添加剂混菌发酵奠定基础。

1  实验部分

1.1  材料

1.1.1  菌株

菌种来源于中粮生物科技股份有限公司安徽研发基地。

1.1.2  试剂

蛋白胨酵、母粉浸粉FM 812、硫酸铵、牛肉浸膏、葡萄糖、硫酸镁 、磷酸氢二钾、硫酸锰、氯化钠、碳酸钙，均购买于北京奥博星生物技术有限责任公司。

1.1.3  仪器及设备

艾贝泰全自动5 L发酵罐、立式压力灭菌锅、无菌净化台、分析天平、LRH-150生化培养箱、722可见分光光度计、pH计、电子调温电炉、1 000 mL烧杯、1 000 mL三角烧瓶、500 mL蓝盖瓶。

1.1.4  培养基

固体培养基：蛋白胨 1%，牛肉粉 1%，酵母粉 0.5%，葡萄糖 2%，醋酸钠 0.5%，柠檬酸三铵0.2%，磷酸氢二钾 0.2%，吐温80  0.1%，硫酸锰0.05‰，硫酸镁 0.1‰，琼脂粉 1.6%。，蒸馏水定容至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，温度降至50 ℃左右备用。

种子摇瓶培养基：蛋白胨1%，牛肉粉 1%，酵母粉 0.5%，葡萄糖 2%，醋酸钠 0.5%，柠檬酸三铵 0.2%，磷酸氢二钾 0.2%，吐温80  0.1%，硫酸锰 0.05‰，硫酸镁 0.1‰，121 ℃灭菌20 min。

发酵罐培养基：酵母浸粉 3%，醋酸钠 0.5 %，柠檬酸三铵 0.2%，磷酸氢二钾 0.3%，磷酸二氢钾0.2‰，氯化0.2%，吐温80  0.1%，硫酸锰0.3‰，硫酸镁0.2‰，无水葡萄糖 2.2%，碳酸钙 0.5%，淀粉 4.4%，121 ℃灭菌20 min。

1.1.5  活菌数检测

将0.85%生理盐水灭菌后样品按1 mL溶于9 mL生理盐水中10倍稀释即为10-1梯度，同样操作稀释到10-2至所需的稀释梯度，取稀释液1 mL与空平皿中，倾注MRS琼脂培养基20 mL，每个梯度倾注两个平行样，平皿培养48 h菌落数30～300个之间即可读数，最后取平均值计数。

1.2  实验方法

1.2.1  一级摇瓶培养

将保存在超低温冰箱中植物乳酸杆菌提前0.5 h自然解冻，接种量为0.2%，34±2 ℃静置培养。待OD值长至6～7，pH为4.0左右，一级种子摇瓶结束。

1.2.2  二级摇瓶培养基优化

将一级摇瓶转接至二级发酵培养基中，接种量为1%，34±2 ℃静置培养。待OD值长至6～7，pH为4.0左右，二级发酵摇瓶结束。

1.2.3  5 L自动发酵罐培养

5 L发酵罐按照70%～80%的体积比装液，调节pH到6.4±0.2，然后将培养好的二级摇瓶种子液以3%（v）的量接入5 L罐，温度控制在35±2 ℃、转速50 r/min，发酵周期18 h左右。

1.3  实验设计

（1）发酵液中营养成分对菌体代谢的影响。研究碳源对菌体代谢的影响[3]，在发酵液中加入淀粉+葡萄糖混合物、淀粉、葡萄糖、蔗糖，添加比例均为2%;研究氮源对菌体生长和代谢的影响，在培养基中选择加入酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉、玉米浆，添加比例按照3%;研究无机盐对菌体生长代谢的影响，在发酵液中加入碳酸钙、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠，具体浓度见表1，试验无机盐对菌体的影响。以上试验都选择在500 mL蓝瓶盖中培养，装液量60%，培养温度为35 ℃、静置培养，发酵周期22 h，最后检测菌体密度。

（2）不同发酵酸度对菌体生长的影响。通过上表试验结果，配制起始pH值不同的物料：5.0、5.5、6.2、6.8、7.2，研究初始pH值对菌体生长的影响;分别装入培养基300 mL于500 mL蓝瓶盖，恒温35 ℃培养22 h后检测OD值。以上均培养3个重复性试验。

1.4  分析方法

1.4.1  益生菌数量

按照MRS琼脂平板倾注法检测乳酸益生菌含量。

1.4.2  菌密度检测

使用722可见分光光度计检测，波长600 nm。

1.4.3  pH值

pH计直接检测。

2  结果与分析

2.1  不同碳源及混合比例对菌体生长的影响

碳源是构成物质细胞的基础，是培养基组成的主要成分。由图1得知，植物乳酸菌菌体密度因碳源不同活菌数不同，其中以单一碳源与混合碳源相比较，淀粉与葡萄糖相结合为碳源使植物乳酸菌菌体活菌数最高，碳源对菌体生长有明显影响，淀粉与葡萄糖相结合发酵效果最佳，活菌数达7.2×1011 CFU/mL。

2.2  不同氮源及浓度对菌体生长的影响

微生物生长和代谢需要氮源，主要用于菌体细胞壁（蛋白质、氨基酸）和代谢产物的合成[4]。选取5种有机氮源：酵母浸粉FM812、玉米浆、蛋白胨、牛肉膏、黄豆饼粉添加到摇瓶基础培养基中[5]。植物乳酸菌对几种氮源利用发酵效果不同，活菌数最佳的是酵母浸粉，具体见图2所示。

根据上图得知，酵母浸粉作为碳源对菌体生长有显著影响，主要由于酵母浸粉中的叶酸、尼克酸、钴胺素含量较高，其在中性和酸性对热稳定，且富含多种氨基酸，对菌体生长有明显的促进作用[5]，因此使用酵母浸粉为最佳碳源[6]，本实验结果也符合这种结论。

将发酵培养基中酵母浸粉不同添加量对植物乳酸菌菌体生长的影响做进一步研究，其浓度为25 g/L和35 g/L时，菌体活菌数相当，考虑节约成本，所以优先选择浓度为25 g/L，已达到高密度发酵效果，实验结果如表3所示。

由表3可以看出，当酵母浸粉浓度25 g/L时，发酵效果最佳。

2.3  无机盐对菌体生长的影响

菌体生长不但需要碳源和氮源类营养因子，同时也需要无机盐、生长因子等。无机盐的主要功能是合成菌体的结构成分，参与能量的储存和运作，调节菌体内外渗透压等。为研究无机盐对菌体生长的影响情况，调配4种不同浓度组合的无机盐进行试验，结果如图3所示。

上图结果显示，无机盐浓度组合3活菌数最优，为5.5×1011 CFU/mL。根据试验结论配制最适碳源、氮源、无机盐培养基。菌体生长环境需要一定添加量的微量元素，二价锰离子就是其中的一种[7]，二价锰离子使菌体生长速率较高，当浓度超过临界值时，反而会抑制菌体生长。

2.4  pH值的影响

pH值決定着生物大分子的结构和活性的许多方面，微生物的生长和生物合成都需要在合适的生长环境中，太高或太低的pH值均不利于菌体生长繁殖[8]。大部分菌体生长在酸度条件下，当pH 大于7.5或小于4.5时，生长和发育缓慢或停止。所以配制初始pH为 5.2、5.8、6.2、6.8、7.2的发酵培养基来研究菌体生长最合适的酸碱条件，具体见图4所示。

从图4可知，初始pH值小于6.2与大于6.2终点OD值均偏低，初始pH值6.2时，菌体的生长条件最适宜，因此植物乳酸菌菌体生长的最适宜pH值为6.2。

2.5  5 L艾贝泰自动发酵罐发酵验证

根据摇瓶试验结论，配制5 L艾贝泰发酵罐发酵物料。发酵培养基浓度：淀粉+葡萄糖混合2∶1比例、浓度为2%，酵母浸粉浓度2.5%，无机盐选组合3，培养温度35 ℃，转速50 r/min，具体结果见图5。

从图5可知，开始8-12 h内植物乳酸菌都在迅速生长;12 h以后进入稳定期，活菌数增值较明显;培养16 h后活菌数达最高，为8.2×1011CFU/mL;18 h后活菌数成下降趋势，发酵培养结束。试验所示，在5 L艾贝泰发酵罐中其发酵效果较好，并对发酵液货架期跟踪，发酵液保存周期较长，在75 d的跟踪检测中活菌数无数量级变化，具体如表4所示。

3  结 论

以植物乳酸菌为菌种进行高密度培养基优化，经过对碳源、氮源、无机盐以及环境因素等条件的研究，通过摇瓶试验得出有利于菌体生长及代谢产物形成的发酵配方：最佳氮源为酵母浸粉;最佳碳源是比例为2∶1的混合型淀粉+葡萄糖;最佳无机盐为组合3。用5 L发酵罐在初始pH值为6.2时进行发酵验证，菌体密度大幅度增加，活菌数上升趋势明显，可以得到高密度发酵水平，活菌数为8.2×1011 CFU/mL。发酵液保存周期较长，在75 d的跟踪检测中活菌数无数量级变化。

参考文献：

[1]张楠，尹望，李雪平.植物乳酸菌高密度发酵工艺研究[J].中国饲料添加剂，2019（4）：44-46.

[2]李秀，李芹，毕瑜林.日粮中添加微生态制剂对苏禽黄鸡生长性能和屠宰性能的影响 [J]. 广东饲料，2011，20（3）：16-19.

[3]王法富，刘梦涵，刘利利.枯草芽孢杆菌出芽培养条件优化[J].当代化工，2018，47（2）：286-289.

[4]魏全彬.β-甘露糖苷酶产生菌株的分离鉴定、产酶条件优化及其酶学性质研究  [D]. 成都： 四川农业大学，2012.

[5]赵静，梁金钟直投式产白塔-氨基丁酸植物乳酸菌冻干保护剂生产工艺优化[J].食品工业科技，2015，36（9）：31-38.

[6]李志成，张连斌，段旭昌，等.嗜酸乳杆菌生长促进物质研究[J].中国食品学报，2006，6（5）：40-44.

[7]赵玉鉴，李胜钰，李玉娟，等.益生性植物乳杆菌C88高密度培养条件优化研究[J].中国乳品工业，2014，42（1）：7-10.

[8]周德庆.微生物学教程[M]. 北京：高等教育出版社，1993.

[9]劉辉，乔海峰，王四新，等.饲用乳酸菌高密度培养的研究进展[J].中国饲料，2016（4）：11-14.