正交试验法优选一种抗病毒方药中多糖类物质的最佳提取工艺

刘富菁　王思琪　陶然　王娅玲　于慧心　王集会

摘      要：为了优化抗病毒方药中多糖类物质的最佳提取工艺条件，提高多糖得率，采用L₂₇（3¹³） 正交试验法，考察超声温度（A）、提取时间（B）和料液比（C）3个因素对方药中多糖类物质提取率的影响，同时考察其中存在的交互作用（A×B、A×C和B×C），并最终获得最佳的提取工艺条件组合。结果显示：最佳工艺条件组合为A₃B₂C₃，即超声温度为70 ℃、提取时间为30 min、料液比为1∶30。在最佳工艺条件组合下，测得方药中多糖的提取率为40.48%，并且该最佳工艺稳定可靠。

关  键  词：抗病毒方药;多糖提取;正交试验;交互作用

中图分类号：R284.2          文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）06-1099-04

Optimum of Extraction Processof Polysaccharides From the Antiviral Prescription by Orthogonal Test

LIU Fu-jing¹， WANG Si-qi¹， TAO-Ran¹， WANG Ya-ling¹， YU Hui-xin¹， WANG Ji-hui²*

（1. College of Pharmacy， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China;

2. ExperimentalCenter， Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan Shandong 250355， China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of polysaccharide from the antiviral prescription to improve the yield， the effect of three factors including temperature（A）， extraction time（B）， solid-liquid ratio（C） on the yield of polysaccharides was investigated by L₂₇（3¹³） orthogonal experiment， and the possible interactions of A×B， A×C and B×C were investigated. Finally， the optimal optimum extraction conditionswere determined. The results showed that， the optimum extraction conditionswasA₃B₂C₃， that was， the temperature 70 ℃， the extraction time 30 min， and the solid-liquid ratio 1∶30. Under the optimal extraction conditions， the yield of polysaccharides was 40.48%， and the optimal process was stable and reliable.

Key words： Antiviral prescription; Extraction of polysaccharides; Orthogonal test; Interaction effect

人类历史上曾记载着许多近乎灾难的大型疫情，如新冠肺炎、非典、艾滋病等，这些“杀人于无形”的疾病的始作俑者便是病毒，一种肉眼无法看到的最小生物病原体，而越来越多变异病原体的产生，使病毒性疾病治愈的难度随之增加^[1]。面对巨大的生命健康威胁，人们在抗病毒方面的投入也越来越大，而中药也因其悠久的应用历史和诸多疫情防治的成功历史，为广大研究者提供了丰富的经验参考和有力的信念支持^[2]。

尽管中药^[3]在抗病毒方面并没有西药^[4]那么强的针对性，但中医强调的天人合一的整体观念、辨证论治的理法方药和中药多组分多靶点的药理特点，使其在治疗各种疑难杂症中具备了得天独厚的优势，也因此奠定了其不可替代的防治价值^[5]。

多糖是一种能参与许多生命过程的生物大分子，其结构的多样性决定了其生理功能的多样性和生物活性的差异性。据研究多糖类物质主要通过增强机体免疫功能来达到抗菌、抗病毒和抗癌的效果。近年来，国内外与多糖相关的研究进度神速，而对多糖提取分離的工艺研究是研究多糖高级结构的重要基础^[6]。

本次试验旨在对所选抗病毒方药中多糖类物质的最佳提取工艺条件进行研究，确定最佳的提取时间、超声温度、料液比等，为该方药的进一步研究提供一定的参考。

1  试验材料

紫外可见分光光度计，UV9100B型，北京莱伯泰科仪器有限公司等试验器材。

苯酚，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号20150108;白术、白头翁、蛴螬、美洲大蠊、当归、川芎，在河北安国中药材市场所购买，粉碎成粗粉后，储存备用。

2  试验方法

2.1  标准曲线的获取

精密称取干燥恒重的葡萄糖20.00 mg，加水溶解并定容至100 mL，分别精密移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL规格的干燥洁净的容量瓶中，混匀并定容;再分别精密的移取各浓度标准溶液2.00 mL，放置于干净干燥试管中，进而移取1.00 mL质量分数为5%的苯酚溶液^[7]，略微振摇，将5.00 mL的浓硫酸加入其中，快速混匀后在室温下安静放置20 min，而后放在40 ℃水浴锅中保持温度10 min，使其充分反应，并在490 nm处测量其吸光度^[8]。把葡萄糖的质量浓度x作为曲线的横坐标轴，吸光度y作为曲线的纵坐标轴，进行标准曲线的绘制^[9]。

2.2  抗病毒方药中多糖类物质的提取

2.2.1  超声提取方法

精密称取抗病毒方药粉末1.000 g，放置于干燥洁净的三角烧瓶中，加入固定量的蒸馏水，在固定的时间、料液比和温度下进行超声提取，取出并抽滤，滤液定容待用^[10]。

2.2.2  多糖类物质的含量测定

用移液枪精密移取上述滤液0.05 mL，加入到干燥洁净的10 mL容量瓶中，加水混合均匀，定容至刻度，待用。精密移取上述溶液1.00 mL于具刻试管中，采用2.1.2相同方法测量其吸光值A，并计算出质量浓度ρ，进行下式计算。

多糖类物质的提取率=[p×7×10×（v÷0.05）]/1000×m= ×100%^[11]。

2.3  单因素分析试验

保持其他条件不改变， 分别考察超声时温度（40、50、60、70、80 ℃）、物料液体比值（1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50）、提取持续时间（10、20、30、40、50 min）^[12-13]3个因素对多糖类物质得率的影响。方法同2.2.1和2.2.2。3次平行试验，取平均值进行分析，最终确定正交试验设计中各因素的水平数值。

2.4  正交试验设计

基于2.3中试验的结果， 进行下一步的实验设计，选定上述3个因素的3个水平进行L₂₇（3¹³）正交试验，试验中的各个因素以及各个水平见表1，同时关注各因素之间可能存在的交互作用（A×B、A×C、B×C），观察多糖提取率的数值变化，得出最优工艺条件的组合，并采用SPASS软件进行统计学分析^[11]。

3  结果及分析

3.1  葡萄糖标准曲线方程

经实验所得曲线见图1。

回归方程y=54.836x+0.000 2，相关系数R²=0.999 4。

3.2     超声温度對方药中多糖类物质提取率的影响

试验方法采用2.2.1、2.2.2方法，物料液体比值定为1∶40、超声持续20 min下，考察不同超声温度的影响作用。分析图2可知，超声温度对方药中多糖类物质的得率影响很明显，超声温度不断变高，多糖提取率迅速增加，50 ℃以后多糖提取率增幅略变大，当超声温度升至60 ℃，多糖提取率到达最高值附近，之后呈现下降趋势，所以试验暂定60 ℃为最佳超声温度。

3.3  料液比对方药中多糖类物质提取率的影响

按2.2.1、2.2.2方法，在50 ℃的温度下进行超声10 min的处理，考察不同料液比的影响作用，结果见图3。

通过图3可以看出，料液比对抗病毒方药中多糖提取率的影响是比较明显的，随着加入的提取溶剂的增大，多糖得率有逐渐上升趋势，当料液比升至1∶20时，多糖提取率到达最高值附近，之后呈现缓慢下降趋势，所以试验暂定1∶20为最佳料液比。

3.4  提取时间对方药中多糖类物质提取率的影响

按2.2.1、2.2.2方法，在50 ℃的温度下进行超声处理、且物料液体比值为1∶40，考察不同超声时间的影响作用。分析图4得，提取时间对多糖类物质的得率影响较明显，超声时间加长，多糖提取率有所提高，时间达到30 min对应多糖提取率到达最高值附近，随后缓慢变小，最终试验暂定30 min为最佳提取时间。

3.5  正交试验结果及方差分析

3.5.1  正交试验结果

试验结果见表2。

3.5.2  试验结果的方差分析

试验结果的方差分析见表3。

由方差分析表3可知，A、B、A×B和A×C对多糖类物质提取率的影响极显著，而C和B×C对指标的影响具有显著性差异。极差由大到小依次为A、B、A×C、A×B、C、B×C^[14]。A、B、C及它们之间的一级交互作用均对该抗病毒方药中多糖类物质的提取率有极显著或显著性影响，最佳提取工艺组合为A₃B₂C₃。为进一步证明上述最佳水提工艺是持续稳定和可靠的，在上述条件下进行平行实验3次，得多糖类物质的提取率达40.48%（R_SD= 1.34%），表明此最佳提取工艺稳定性及可靠性良好^[14]。