中药降脂复方中总蛋白提取优化及抗氧化实验研究

王娅玲 于佩琳 李佳怿

摘      要：近年来高血脂症发病率一直处于上升趋势，中药治疗高血脂症独特的功效引起人们广泛的关注。为考察山东中医药大学实验室自制减肥降脂复方降血脂功效，设计响应面优化实验测定复方中蛋白质含量，研究超声时间、pH、料液比三个因素对复方中蛋白质得率测定的作用， 分别在50 min、10、1∶40 mg·mL-1时， 复方中蛋白质得率最佳，并在此条件下测定对DPPH自由基的抑制情况。

关  键  词：自制新复方;蛋白质;蛋白质含量测定;工艺优化;高血脂症

中图分类号：TQ 041       文献标识码： A       文章编号： 1671-0460（2020）04-0552-04

Abstract： At present， the incidence of hyperlipidemia has been on the rise， and the unique efficacy of traditional Chinese medicine in treating hyperlipidemia has aroused widespread concern. In order to investigate the lipid-lowering effect of the self-made weight-reducing and lipid-lowering compound prescription made by the laboratory of Shandong university of traditional Chinese medicine， response surface optimization experiment was designed to determine the protein content in the prescription. the effects of ultrasonic time， pH， and solid-liquid ratio on the determination of protein content in the compound prescription were investigated. the protein yield was the best when 50 min， 10， and 1∶40 mg·mL-1 respectively， and DPPH radical scavenging capacity was determined under this condition

Key words： Chinese medicine fat-lowering complex; total protein content; hyperlipidemia; process optimization

中藥降脂复方含有多种活性成分[1]，对机体有多种作用，可以弥补西药的不足。中药降脂复方均为植物药，相较于化学合成药物毒副作用更小。当下基于植物成分的药物治疗已成为当前关注热点[2]。中药降脂复方由灵芝、芦荟、大黄、砂仁、炒芡实、桔梗等组成，能够调节代谢紊乱、显著降低细胞氧化速度 [3]，从而发挥降血脂的功效。

本实验采用超声提取法，蛋白质在水中的溶解量增加，相较于传统水提法，对蛋白质提取更加充分，并采用优化实验确定复方中蛋白质的最佳提取方案，在最佳方案下测定复方中蛋白质对自由基的抑制效果，综合评价该复方的降血脂能力，以期为推动中药应用更加广泛化。

1  实验用品

1.1  试剂

牛血清蛋白（上海伯奥生物科技公司）、酒石酸钾钠、DPPH、福林酚等均为分析纯[4]。

1.2  器材

PHS-25型pH计; Mettler AE240电子天平[5] ; HH-4数显恒温水浴锅; 紫外可见分光光度计等。

2  方法

2.1  实验设计

2.1.1  标曲绘制

称取0.02 g牛血清蛋白样品，超声混匀定容为100 mL，配置待测溶液。分别吸取溶液，移液枪移取现配的碱性铜溶液5 mL，震荡，静等10 min，避光加入福林酚试剂0.5 mL，反应30 min[6]，测定吸光度，所得回归方程为：

y=0.180 1x-0.006 3，R2=0.999 0

2.1.2  总蛋白含量测定

精确称取1.0 g药品，恒温超声水提50 min，充分溶解后，抽滤， 重复两次实验，加蒸馏水至100 mL， 精确量取6 mL， 再次定容为100 mL [7]。

2.1.3  单因素实验

进行实验以此确定响应面实验各因素作用的最大值[8]，前后各取一个因素，降低试验误差，减少试验次数。

2.1.4  响应面优化实验

综合单因素实验结果，每个因素取三个水平，采用超声水提对复方中蛋白质提取优化[9]，以蛋白质得率为指标，见表1。

2.2  体外抗氧化实验

制备标准DPPH乙醇混合液，对照品为维生素C，避光操作，参照文献操作检测溶液的吸光度。

3  结果

3.1  优化实验

超声时间、料液比、pH之间的二次项回归方程为：

Y=36.34+0.075A-0.87B+3.41C+0.20AB+1.93AC-2.38BC+2.32A2-1.22B2-2.07C2

方差分析结果见表2。

方差评估P值<0.000 1，表明实验数据误差较小[10]，操作过程较为规范;由表3可知，R2=0.920 5， Radj2=0.818 3，二者差值较小，表明所建回归方程的拟合程度较好，可用于响应值预测。超声时间、料液比的P值均大于0.1，表明这两个因素对蛋白质含量测定干扰作用较小[11]，pH值对复方中蛋白质的测定影响较明显。PAB、PAC均大于0.1，说明A与B、A与C之间的相互作用对蛋白质含量测定的影响程度较小，因此实验结果较为准确。根据F值可判断这三个因素对实验结果的影响程度[12]，因此三个因素的作用大小为pH>料液比>超声时间，蛋白质的提取受超声时间的影响较小，蛋白质结构较为稳定，超声波不会破坏蛋白质组成。

3.2  交互作用分析

响应面图用于反映因素与结果间的作用关系。曲线越平缓说明考察因素对实验结果作用越不明显;等高线紧密、弯曲弧度较大，证明考察因素之间的作用对蛋白质提取干扰程度较小，数据间相互独立性较强。响应面曲线呈二次抛物线形，在所测范围内存在极值。见图1，曲面斜率较小，随着料液比浓度比例增大，蛋白質含量检测变化不大，结合ANOVA分析结果，料液比对蛋白质含量检测作用很小，pH对实验结果影响较大，PBC=0.004 63<0.05说明二者之间存在交互作用，且交互作用对蛋白质含量检测干扰程度较大[13];由图2可知，曲面较平缓，二者之间的交互作用极小，几乎可以忽略，可能原因为蛋白质虽受pH影响较大，但在超声溶出阶段受影响较小[14]，蛋白质本身结构稳定，双螺旋结构不易被破坏。由图3可知，结合方差分析结果，PA=0.991 7，PB=0.250 9， 均大于0.1，说明干扰程度较小，其交互作用对实验结果的干扰几乎可以忽略。

由图2可知，双曲面平缓，等高线稀疏，表明超声时间和pH值对蛋白质含量测定的影响不显著，其交互作用干扰也较小，可能原因为超声时间过长蛋白质结构被破坏，其他成分的浸出使蛋白质得率变小。

由图3可知，当料液比为1∶50 g·mL-1时，蛋白质溶出量随超声时间的延长而增加，超声50 min后得率开始降低，干扰蛋白质的提取。

3.3  抗氧化实验结果

中药降脂复方能够明显抑制体内的氧化反应，见图4，待测溶液中蛋白质含量越多[15]， DPPH自由基的抑制能力越显著，溶液浓度为0.45 mg.mL-1，曲线不再上升达到最大值[16]。对自由基的抑制能力可反应药物的抗氧化效果[17]，所测溶液的吸光度越大，DPPH自由基抑制率值越大。

4  结论

目前关于蛋白质的研究众多，通过体内蛋白质的变化判断机体疾病的动态变化[18]。阮之平[19]等研究发现蟾蜍多肽具有抗肿瘤活性，能够阻滞癌细胞扩散和分化;梅兵[20等]总结了鹿茸多肽能够治疗骨骼损伤、促进愈合、保护心肌;刘巧[21]通过地龙蛋白质发现其具有很好的抗凝血、消炎作用。因此，中药中的蛋白质作用仍有待研究。

参考文献：

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