分子技术在糖尿病足感染病原体鉴定中的应用进展

谭惠婷，安 敏，李青华，李柳然，张 桦

南方医科大学珠江医院 内分泌代谢科，广东广州 510280

国际糖尿病联盟最新数据显示，2019 年因糖尿病或其并发症死亡的人数约占全球全因死亡人数的11.3%[1]。其中，糖尿病足是重要原因之一。有学者估计，糖尿病患者中糖尿病足溃疡的患病率高达19% ～ 34%[2]。糖尿病足溃疡处理不当会发展为糖尿病足感染，15%的糖尿病足感染患者由于感染恶化最终不得不截肢[3]。因此对于糖尿病足患者来说，早期诊治、避免感染恶化较为关键。感染控制不彻底主要归咎于病原微生物鉴定的不足以及缺乏对微生物群落的全面认识。目前应用于糖尿病足感染的病原体鉴定主要包括两大类—培养法及分子技术。前者包括传统的微生物培养技术及培养组学，后者主要包括16S rRNA 测序、宏基因组测序、转录组测序等。本文将对国内外现有的糖尿病足感染病原体的鉴定技术进行总结，重点介绍相关分子技术及其在指导糖尿病足患者抗感染治疗中的优势。

1 培养法

1.1 微生物培养法 微生物培养法在初步表征糖尿病足感染的微生物学信息中起到重要作用，此法具有低成本、操作简易、技术成熟等优点，是目前临床上研究糖尿病足感染的主流方法。临床研究显示糖尿病足感染患者培养出的最常见致病菌是金黄色葡萄球菌[4-5]。一项纳入126 名患者的研究共分离出134 种病原体，最常见的两种菌依次是金黄色葡萄球菌(35%)、铜绿假单胞菌(15.6%)[6]；同时该研究还发现溃疡的严重程度可能会影响培养的结果，随着糖尿病足严重程度的增加，革兰阴性细菌(尤其是粪肠球菌)的比例也增加。但微生物培养法在一些情况下容易产生假阴性结果，如生长缓慢或培养条件苛刻的致病菌、厌氧菌以及在接受抗生素治疗的患者中采样等[7]。因此不一定能真实反映出糖尿病足感染的重要生物学信息或微生物种群的全貌。而且培养法耗时相对较长，阻碍了敏感抗生素的及时应用，一定程度上影响患者有效治疗。

1.2 培养组学 培养组学主要使用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱以优化培养条件，促进传统培养法难以培养的病原体生长[8]。其通过细菌蛋白质产生独特的“质谱指纹”来识别细菌的种属[9]。一项关于培养组学的研究显示，从43 例中重度糖尿病足患者中分离出的需氧菌主要为金黄色葡萄球菌(52.8%)、葡萄球菌(18.7%)、表皮葡萄球菌(11.3%)；厌氧菌主要为粪肠球菌(45.2%)、阴沟肠杆菌(22.6%)、奇异变形杆菌(11.3%)和大芬戈尔德菌(9.4%)，并且88.3%样品是混合性感染。另外，金黄色葡萄球菌与伤口恶化相关，但伤口中某些凝固酶阴性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、沙门菌)与伤口愈合有关[10]。可见培养组学描绘相当丰富的细菌多样性，并且加深我们对细菌与宿主之间的认识。但此法需要通过质谱仪分析较大数量的新鲜菌落，存在工作量大和无法进行大样本检测的局限性。同时，由于无法识别尚未培养成功的微生物，从而造成一定的假阴性结果。更重要的是，培养组学不能像分子技术那样直接提供有关基因表达和细菌潜在功能的数据[8]。

2 分子技术

2.1 16S rRNA 测序法 16S rRNA 基因在细菌进化过程中高度保守，该基因具有9 个高度可变的区域(V1 ～ V9)，不同细菌种群之间具有序列多样性，因此可通过该序列鉴定细菌的特定属或种[11-12]。根据序列的相似程度，通过计算机分析后分为可操作的分类单位(operational taxonomic unit，OTU)，OTU 相似性为97%或以上通常被认为属于同一种属水平[13]。

16S rRNA 测序法与传统培养法比较，不仅检出率更高，而且可测出更多细菌物种数量。Dowd等[14]的研究显示，传统细菌培养在55%的患者中显示有革兰阳性细菌生长，16S rRNA 测序则为75%；而嗜胨菌属、厌氧球菌属以及棒状杆菌属只在16S rRNA 测序中分析出来。同样，Gardner等[15]的研究也发现培养法极大地低估了微生物负荷和潜在病原体的存在。此外，Banerjee 等[16]将培养法及PCR 法鉴定结果为阴性的10 个样本以16S rRNA 测序再次鉴定，结果显示其中6 个样本存在变形杆菌属、产碱杆菌属、鞘氨醇单胞菌属。国内胡萍等[17]基于16S rRNA 测序分析糖尿病足骨髓炎感染的病原微生物，与培养法相比，16S rRNA 测序除了阳性检出率较高、平均每个样本病原菌数较多以外，革兰阴性菌所占的比例也较高(67.16% vs 50.00%)，甚至检测出不存在于培养法的菌属13 种，其中11 种为专性厌氧菌或严格厌氧菌，证实16S rRNA 测序更为准确全面，尤其对革兰阴性菌和厌氧菌有显著的优势。在鉴定罕见细菌时16S rRNA 测序分析也显示独特的优势。通过16S rRNA 测序方法在糖尿病足中检测到了食酸戴尔福特菌、嗜线虫沙雷菌、唾液链球菌、核粒梭杆菌、琥珀酸杆菌、佩滕科费尔葡萄球菌等培养法较少培养出的菌种[18]。

不可忽略的是，16S rRNA 测序同样存在一定的局限性。如基因的特定区域需要与相应的引物结合以产生PCR 产物，因此引物的应用不足也会导致假阴性结果的出现。此外，相关性较高的物种之间，高度可变区的多样性会降低，需要设计多个引物组来扩增不同高度可变区，以减少误差。同时，由于此法是扩增所有DNA，因此无法区分存活和死亡病原体；人线粒体DNA 的污染也会造成假阳性结果[13]。而且，16S rRNA 测序仅限于测病原体基因组的单个区域，缺乏对糖尿病足感染机制的认识，如细菌的功能途径、生物膜、毒力因子、抗菌药敏感度等。

2.2 宏基因组测序法 宏基因组测序是利用非靶向测序来测定样品中所有微生物的基因组，能够弥补培养法和16S rRNA 测序法的不足[19-20]。这种新兴的技术使微生物群落的潜在功能、种群之间的相互作用更加清晰，甚至对复杂伤口的遗传潜力进行全局表征[21]。随着测序通量的增加和测序成本的下降，宏基因组测序在临床上崭露头角。

Kalan 等[22]利用宏基因组测序法对100 例无感染症状的糖尿病足溃疡患者标本进行分析，在菌株水平方面研究样本的微生物群落，并鉴定微生物的毒力和致病性。这项研究显示，糖尿病足患者中最丰富的细菌为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、纹带棒杆菌和粪便产碱杆菌，此外还有疏螺旋体属、产酸克雷伯菌、不解糖卟啉单胞菌等少见菌种。

为了分析糖尿病足感染微生物组的基因功能，研究者通常利用SEED 数据库(种子数据库)预测微生物的作用途径[23]。Kalan 等[22]的研究表明，较深且氧合不良的伤口与微生物高代谢密切相关，包括荚膜、细胞外多糖和糖酵解的产生等。创面的不愈合及严重程度与金黄色葡萄球菌菌株相关，且首次提出金黄色葡萄球菌7372 和金黄色葡萄球菌10757 菌株是糖尿病足溃疡的优势菌株，基因组比对分析显示，两者以不同的噬菌体依赖性控制毒力相关的基因座。金黄色葡萄球菌7372 株还富含与免疫逃逸相关的不同毒力因子、扩散感染的葡萄球菌激酶、抑制人类免疫调节作用和吞噬作用的scn 基因等致病因子。然而，葡萄球菌肠毒素C-2、肠毒素A 则为金黄色葡萄球菌10757 株所独有。正是基于基因组检测出致病菌的多样化导致不同的宿主反应和临床结果。

宏基因组测序虽能提供样本中微生物群落基因的“全景图”，但无法区分基因是表达还是沉默，因此可能会造成假阳性结果。另外，宏基因组测序产生巨大而复杂的数据库，可多达数百Gb 的数据序列，而回收的DNA 序列是片段性的，因此在宏基因组测序数据中发现新的非编码RNA(ncRNA)和核糖开关相比在单个基因组中更加困难[24]。

2.3 转录组测序法 转录组测序法利用样品中分离出的mRNA 挖掘群落中活性基因的多样性及表达谱[25]。其能识别基因表达的生物特征，同时避免了微阵列的基因鉴定、交叉杂交、背景噪声等缺点[26]。Leung 等[27]对感染肺炎克雷伯菌或铜绿假单胞菌的伤口进行转录组分析发现，伤口周围细胞特异性转录产物的下调以及浸润性白细胞特征转录物的上调可作为伤口愈合不良或伤口特异性治疗的标志物。Karna 等[28]发现伤口从感染到愈合的过程中，不同类别ncRNA 的调节遵循连续且协调的模式。该研究评估了伤口在对抗铜绿假单胞菌感染时的转录组变化，在伤口接种细菌后的2 h，伤口边缘下调的基因包括几乎所有的ncRNA( 包括snoRNA，miRNA) 和RNU6 假基因，这些下调先于皮肤富集编码基因表达的下调。但随着感染的加剧，在下调的基因中，ncRNA 的表达仍然过多。感染5 d 和9 d 后，对照组ncRNA 数量减少，而仍存在感染或愈合欠佳的伤口，ncRNA数量增加。

值得注意的是，蛋白组学在病原体鉴定方面也能识别基因表达的生物特征。虽未见使用蛋白组学对糖尿病足病原体鉴定以及其致病机制的研究，但Klein 和Rianey 等[29-30]利用蛋白组学解释口腔疾病中变形链球菌的致病机制，表明蛋白组学在研究病原体致病方面具有一定的潜力。目前，关于糖尿病足感染方面尚无将宏基因组测序与转录组测序或蛋白质组学结合使用的研究报道。但Lassek 等[31]将宏基因组测序与蛋白质组学结合起来，很好地分析生物膜相关的尿路感染致病机制。通过宏基因组测序进行群落分析，铜绿假单胞菌和摩根菌均被鉴定为主要微生物。蛋白质组学分析随后在功能水平上明确铜绿假单胞菌上调了参与红细胞降解、铁载体系统、生物膜、抗生素耐药和致病性等的蛋白质水平。另外，蛋白组学数据的质量与宏基因组学分析的质量密不可分。蛋白组学需要根据宏基因组学来预测蛋白质数据库。可见，宏基因组发挥优势的同时，若结合其他分子技术(如转录组学、蛋白质组学)研究糖尿病足感染，可能会达到事半功倍的效果。

3 基于分子技术对糖尿病足感染进行精准治疗

目前糖尿病足的抗菌治疗主要依赖药敏试验，一般采用细菌培养或基于PCR 的方法，但这两者仅限于常见的细菌和抗生素，且采样和运送过程也会极大地影响结果[18]。使用宏基因组学鉴定糖尿病足的病原体耐药基因可以克服以上局限性，并提供有关耐药的所有基因信息[32]。Kalan 等[22]进行的宏基因组测序研究表明，超过50%的样本含有氨基糖苷、大环内酯、β-内酰胺、四环素类的耐药基因，其中金黄色葡萄球菌10757 菌株含有大环内酯类、四环素和氨基糖苷类耐药基因，这可能解释糖尿病足溃疡中多耐药病原体的增加。宏基因组测序仅表明存在编码耐药的基因，而转录组测序可以帮助我们了解耐药基因的表达与否。Hall 等[33]利用转录组测序技术，鉴定了PA3225调控的基因产物(如ABC 转运蛋白PA3228)，发现其可能与铜绿假单胞菌抗生素耐药性有关。更重要的是这些分子技术可以帮助我们对新耐药细菌在临床出现之前进行预测。

欧洲伤口管理协会已禁止对未感染的伤口使用抗生素[34]。但临床工作中，以防发生感染或促进伤口愈合，临床医生经常对未感染的糖尿病足溃疡患者也使用不同种类的抗生素。这无疑加剧了耐药菌株甚至多耐药的“超级细菌”的出现。Messad 等[35]通过基因组比对发现，含有ROSA 样噬菌体的金黄色葡萄球菌菌株并无毒性，这可能解释了该细菌在慢性糖尿病足伤口中的定殖能力以及它们与宿主的共生关系。该研究建议我们尽可能利用有效的方法检测慢性伤口中是否存在增加或降低细菌毒力的噬菌体，以明确使用抗生素的必要性。

4 结语

分子技术让我们对糖尿病足感染的微生态也有了更广阔的认识，尤其是罕见的、培养条件苛刻的病原体。然而，目前国内分子技术在糖尿病足感染中的应用较少，有以下几个客观原因：1)相比传统培养法花费高；2)测序技术要求高；3)对测序结果的解读需要较强的专业知识；4)目前数据库仍需进一步完善。另外也存在一定的主观因素：我们对分子技术的认识不够深入，仅将分子技术作为一种科研工具。随着高通量测序技术的出现和测序成本的下降，临床医生认识微生物的方法不能局限于传统的培养法，应合理利用分子技术进行更多、更完善的系统性临床研究，为梳理糖尿病足宿主与病原体错综复杂的关系、发现更有效的抗感染方法等提供更全面可靠的依据。