Box-Behnken响应面法优化舒肝颗粒(广西方)的水提工艺*

吕 潇，陈思宏，梁 芳，黄艳红，尹善仪，汪 静，谭德慧

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530222)

舒肝颗粒(广西方)收载于广西药品标准(一九八四年版)，原名为舒肝冲剂，标准编号为桂Q/WS-1-380-84，由茵陈、蒲公英、白茅根等9味药材组成，具有疏肝开郁、清热解毒、化湿健脾之功效，用于治疗黄疸型及非黄疸型急性肝炎[1]，对慢性肝炎、迁延性肝炎亦有一定疗效。方中茵陈、蒲公英、白茅根均具有保肝作用[2-5]，所含的有效成分绿原酸是方中酚酸类化合物的代表成分，对肝损害起保护作用[6]，还具有抗菌、抗癌、保护心血管系统及中枢神经系统、免疫调节、细胞保护和保肝等药理作用[7-8]，故本研究以绿原酸含量与浸膏得率的综合评分为考察指标，采用Box-Behnken响应面法优选舒肝颗粒(广西方)的水提工艺，为后续舒肝颗粒(广西方)的制剂生产提供实验依据。

1 材 料

1.1 仪 器

Agilent1200(DAD/ELSD)高效液相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司；Agilent1200色谱工作站，美国安捷伦科技有限公司；XS105DU电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；比朗超声波清洗机，上海比朗仪器有限公司。

1.2 对照品与试剂

绿原酸对照品(批号：110753-201817，供含量测定用，含量以96.8%计)购于中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为Fisher公司的色谱纯，液相用水为娃哈哈纯净水。

1.3 药 材

夏枯草(批号：18102001)、茵陈(批号：18022701)、蒲公英(批号：18082202)、甘草(批号：18102801)、苍术(批号：18092504)、北柴胡(批号：18102202)、虎杖(批号：18051501)均购自广西宝正药业有限公司，马兰草、白茅根购自广西玉林药市，由广西中医药大学赛恩斯新医药学院苑敏副教授鉴定，马兰草为菊科植物马兰头Kalimeris indica(L.)的干燥全草，白茅根为禾本科植物白茅Imperata cylindrical Beauv.var.major(Nees)C.E.Hubb.的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 色谱条件与系统适用性实验

色谱柱为CAPCELL PAK C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(10∶90)，检测波长为327 nm；流速为1.0 mL/min；进样量为10 μL；柱温为30 ℃。分别取供试品溶液和对照品溶液进样测定，记录色谱图。结果，供试品溶液与对照品溶液HPLC色谱图中相应色谱峰的保留时间一致，各相邻峰间分离度均大于1.5，理论板数按绿原酸峰计算不低于5000。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.1.2 供试品溶液的制备

按照处方量的1/10比例称取药材45 g，加入18倍量水，浸泡40 min后，煎煮两次，每次1.3 h，滤过，合并滤液，滤液浓缩至250 mL。精密量取浓缩液25 mL，置50 mL量瓶中，加入甲醇适量，超声处理30 min，放冷，用甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品5.10 mg，置50 mL量瓶中，加50%甲醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4 线性关系考察

分别精密量取“2.1.3”项下的对照品溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，进样10 μL，记录色谱图。以对照品浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得到绿原酸回归方程为：Y=16.857X-3.44，(r=0.9999)。结果表明绿原酸在10.2～61.2 μg范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度实验

精密量取“2.1.4”项下的对照品溶液5#，连续进样6次，测定其峰面积，结果绿原酸峰面积平均值为868.1，RSD=0.16%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验

取“2.1.2”项下的供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、24 h后进样，测定其峰面积，结果峰面积平均值为813.8，RSD=0.73%(n=6)，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.1.7 重复性实验

按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6份，进样测定。结果供试品溶液中绿原酸含量平均值为0.5357 mg/g，RSD=1.42%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验

取已知含量的供试品溶液6份，分别精密加入绿原酸对照品溶液(1.4540 mg/mL)0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，再按“2.1.1”项下色谱条件进样分析，计算平均回收率和RSD，结果均符合要求，详见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2 浸泡时间考察

按照处方量的1/10比例称取药材45 g，加入18倍量水，分别浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min，滤出水分，称定药材吸水后重量，计算药材吸水率。计算公式为：

药材吸水率=(药材吸水后重量-取样量)/取样量×100%

结果显示，药材在40 min前吸水率呈上升趋势，40 min后吸水率改变不大，说明药材在浸泡40 min后吸水基本达到饱和，故浸泡时间定为40 min。

2.3 浸膏得率的测定

精密量取水提浓缩液25 mL，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷却30 min，迅速精密称定重量，计算浸膏得率。计算公式为：

浸膏得率=干膏重量×10/药材重量×100%

2.4 Box-Behnken响应面法优化水提工艺

2.4.1 Box-Behnken试验设计与结果

采用Design-Expert8.0.6软件，选择Box-Behnken响应面试验设计原理，以加水倍数(A，倍)、提取时间(B，h)、提取次数(C，次)为考察因素，以综合评分(R)为响应值，设计进行3因素3水平的响应面法试验，Box-Behnken设计与结果见表2。

表2 Box-Behnken设计与结果

2.4.2 模型拟合及方差分析

采用Design-Expert 8.0.6软件对表3的数据进行回归分析，以综合评分(R)为响应值对加水量(A)、提取时间(B)、提取次数(C)进行多元二次回归拟合，得回归方程为：

Y=-1078.58275+114.53800A+88.10150B+90.80425C+1.15500AB-1.45500AC-4.18500BC-3.17081A2-37.38300B2-14.08075C2。

方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果

由表3可知， B、A2、B2、C2均具有统计学意义，F=40.29，模型项P<0.0001，模型高度显著，失拟项F=4.78，P=0.0823，表明模型失拟项无统计学意义，模型拟合度高，实验误差小。模型的相关系数R2=0.9811，证明该模型拟合度很好，可用该模型对试验结果进行测定。

2.4.3 响应面分析

图2 各因素对综合评分影响的响应面曲线图和等高线图

根据回归模型作出相应的响应面曲线图和等高线图，结果见图2。通过响应面曲线的变化情况及等高线的稀疏程度可直观反映各因素对总含量的影响，响应曲面较陡说明因素间的交互作用显著，等高线的形状可以反映出交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则与之相反。由图2所知，各因素对综合评分的影响交互项强弱顺序为：AC>BC>AB。

2.4.4 验证实验

表4 验证实验结果

采用Design-Expert8.0.6软件预测最佳水提工艺参数：加水量17.82倍，提取时间1.3 h，提取次数2.11次。考虑到实施工艺参数的实际可操作性，将最佳水提工艺条件修正为：加水量18倍，提取时间1.3 h，提取次数2次。为检验修正后工艺参数的合理性，在此条件下平行进行3次验证试验，结果见表4，测得综合评分平均值为99.33%(RSD=0.48%，n=3)，与模型预测值96.46%的相对平均偏差为1.47%，表明该水提工艺条件稳定、可靠，同时也说明建立的回归模型合理。

3 结 论

Box-Behnken设计-响应面法是在科学研究中经常用到的一种实验条件优化方法，适用于解决非线性数据处理的相关问题，它弥补了正交设计和均匀设计等线性模型精密度低的不足，能更好的揭示自变量和非自变量之间的关系。响应面法相对于正交试验法，可以连续地对试验的各个水平进行分析，所得结果更加合理、可靠，还可以预测未知成分，适用于多种因素存在是产生共同影响的试验，从而选出最佳条件和方案[9]。本研究采用Box-Behnken设计-响应面法优化舒肝颗粒(广西方)的水提工艺，通过Design-Expert8.0.6软件对试验数据进行回归分析，得到最佳水提工艺：加水量18倍，提取时间1.3 h，提取次数2次。经验证，测得综合评分平均值为99.33%(RSD=0.48%，n=3)，实测值与预测值的相对平均偏差为1.47%，表明该水提工艺条件稳定、简便易行，结果可靠，可用于后续舒肝颗粒(广西方)制剂生产的水提工艺提取。