海南红树林沉积物中多环芳烃降解菌群组成及降解率的比较研究

龚莹 ，王海花 ，马思远，林雨彬 ，刁晓平, *

1. 海南大学环境与生态学院，海南 海口 570228；2. 海南大学南海海洋资源利用国家重点实验室，海南 海口 570228；3. 海南师范大学生命科学学院， 海南 海口 571158

多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）作为一种广泛存在于自然界中的污染物，对生物具有普遍的致癌性、致畸性及致突变性（Blumer，1976）；又因其疏水性较难被分解利用，能在环境中长时间存在积累（Ribes et al.，2003）而受到广泛关注。地表径流和大气是PAHs传输的主要途径，红树林生态系统处于海洋、陆地、大气的动态交界面，使其更易积累来自三方的污染。已有研究表明红树林表层沉积物中 PAHs的积累量较大，众多红树林超过1500 ng·g−1，香港红树林 PAHs浓度超过5000 ng·g−1，印度塔那溪红树林超过 1600 ng·g−1（Sukhdhane et al.，2015；Domínguez et al.，2010；Klekowski et al.，1994；Tam et al.，2001；Wang et al.，2015；Wu et al.，2014）。由于红树林环境较为特殊且复杂，在长期的自然选择下形成了独特而又丰富的微生物类群（龙寒等，2005）。

目前去除PAHs的方法主要有物理、化学及微生物处理方法。微生物降解PAHs具有低成本，环境安全性高等优点，已成为PAHs污染修复的重要技术（陈铮等，2019）。研究表明可从有PAHs污染的环境中筛选得到PAHs降解菌，已有许多研究从焦化厂、码头等存在PAHs污染的不同环境介质中筛得PAHs降解菌（Arias et al.，2017；李晓斌等，2010；徐虹等，2004）。此类研究多关注单一降解菌的降解特性，但由于单菌对PAHs的降解能力有限，且环境中微生物和PAHs均不是单独存在，故研究PAHs降解菌群具有更好的应用前景。

中国红树林面积共有1.5×104hm2，海南是主要的红树林分布区之一，面积4638 hm2，占全国红树林总面积的33%（陈绵俊，1996；严承高等，1999）。已有研究从海南东寨港等地红树林沉积物中检出PAHs（Qiu et al.，2018；Zhang et al.，2018）。故本研究希望能从海南不同红树林分布区的沉积物中筛选PAHs的降解菌群比较PAHs的降解菌群降解特征，并阐明菌群降解率和菌群结构之间的关系，为环境中PAHs污染区域修复提供理论依据。得到对PAHs降解较为高效的菌群，基于其结构为提高PAHs污染修复效率提供一定参考。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 采样

于2018年8—9月，从海南红树林分布区域(澄迈、儋州、东寨港、三亚、文昌)采集了24个样点的红树林表面0—5 cm沉积物样品。每个采样点设置10 m×10 m的正方形样方，采用五点采样法进行样品采集，5个样品混合均匀后置于冰盒中当天运回实验室进行菌群富集实验。采样点如图1所示。

1.1.2 仪器试剂

仪器：高效液相色谱（HPLC）、氮吹仪、PCR仪、凝胶成像仪、纯水机。

试剂：菲（3-环）、芘（4-环）、苯并(a)芘（5-环）、乙酸乙酯（分析纯）、乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、10%盐度海水（由陈海水配制）、二甲基亚砜（DMSO）。

1.1.3 培养基配制

无机盐（MSM）培养基：K2HPO41 g，NaH2PO41 g，CaCl20.02 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，NaCl 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，NH4NO31 g 溶于蒸馏水中并定容至1 L，调pH至7.0，灭菌待用。

营养（LB）培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g溶于蒸馏水中并定容至1 L，调pH至7.0，灭菌待用。

PAHs A培养基：在灭菌后的锥形瓶中分别加入 1 mL 菲（1 mg·mL−1）、1 mL 芘（1 mg·mL−1）及 0.5 mL 苯并(a)芘（0.5 mg·mL−1）的 DMSO 溶液，待DMSO挥干后加入50 mL MSM。

图1 采样点Fig. 1 Sampling sites

PAHs B培养基：将菲、芘、苯并(a)芘三类PAHs混合液（溶剂为DMSO）加至50 mL MSM培养基中，使培养基中的菲、芘、苯并(a)芘的终浓度分别为 20、20、5 mg·L−1。

PAHs C培养基：PAHs平板筛选培养基，于MSM平板培养基上涂布PAHs A培养基使用的3种PAHs DMSO 溶液，菲（100 μL）、芘（100 μL）、苯并(a)芘（50 μL），挥尽DMSO待用。

1.2 降解菌群富集及其降解率测定

1.2.1 菌群富集

取沉积物样品5 g，置于45 mL灭菌海水（盐度10%）中振荡30 min，后静置5 min，取5 mL上清至45 mL PAHs A培养基中，每个采样点设3个重复。在30 ℃，130 r·min−1转速下进行避光培养，培养至14 d后，取5 mL富集液转接至PAHs A培养基继续培养，连续转接4代，得到混合菌群。

1.2.2 PAHs的提取及分析

取 4 mL 第 4 代的菌液 6000 r·min−1离心 6 min获得菌体，用500 μL MSM悬浮菌液后加入培养基中，以不接种菌液的PAHs B培养基为空白对照，以菌群富集的相同条件培养14 d后，用50 mL乙酸乙酯振荡2 min萃取残留的PAHs。萃取液过滤（0.22 μm滤膜）取1 mL，氮吹干后用乙腈（色谱纯）定容至1 mL，待HPLC测定。

分析仪器为HPLC（Agilent 1260），菲、芘、苯并(a)芘分别使用250、239、295 nm波长检测，进样量为5 μL，流动相为超纯水：乙腈（40：60），流速为 1 mL·min−1。

1.3 菌株分离鉴定

将富集得到的混合菌群用PAHs C培养基培养1代后同种培养基划线分离一代，再用LB平板划线分离纯化得到单一菌落，镜检菌体，再提取得到的单菌落DNA，以27F 5′-AGAGTTTGATCATGGC TCAG-3′， 1492R 5′-TAGGGTTACCTTGTTACG ACTT-3′为引物PCR，将PCR产物送样测序（天一辉远生物科技有限公司）。测序结果在NCBI上blast比对分析，挑选出同源序列，选择相似性较高的序列，并利用Mega软件进行系统发育分析，使用邻接法构建系统进化树。

2 结果

2.1 不同样点混菌的降解率

通过对各个采样点混合菌群降解率的测定，发现本研究区域中所有菌群对3种PAHs的平均降解效率以菲（79%）最高，其次是芘（77%），最低为苯并(a)芘（23%），结果如表1所示。其中，菌群对菲的降解率以Q15最高：95%，Q23最低：14%；菌群对芘的降解率以Q12最高：94%，Q23最低：35%；而菌群对苯并(a)芘的降解率则是 Q9最高：50%，Q19最低仅2%。经统计学分析，发现菲和芘的降解率没有显著性差异（P>0.05），而苯并(a)芘的降解率显著低于菲和芘的降解率（P<0.05）。

表1 混合菌群降解率Table 1 The degradation rates of PAHs by microflora

2.2 混合菌群的群落结构分析

采用分离培养的方法得到的菌群组成如表2所示。其中菲降解率最高的Q15菌群筛得贪噬菌1株，剑菌1株；菲降解率最低的Q23菌群筛得假单胞菌2株，伯克氏菌3株。芘降解率最高的Q12菌群筛得伯克氏菌1株，鞘脂单胞菌1株；芘降解率最低的Q23菌群筛得假单胞菌2株，伯克氏菌3株。对苯并(a)芘的降解率较高共筛得5个菌群，其中对苯并(a)芘降解率最高的为Q9菌群（49.7%），筛得申氏杆菌2株；其次是Q16菌群（48.7%），筛得鞘氨醇杆菌1株，申氏杆菌1株，食酸菌1株，螺旋菌1株；Q3（45.7%）筛得假单胞菌3株；Q15菌群（39.3%）筛得贪噬菌1株，剑菌1株；Q4菌群（33.7%）筛得鞘脂单胞菌1株，申氏杆菌1株，贪噬菌2株。

表2 不同PAHs降解菌群的群落组成Table 2 The composition of degradation bacteria

本研究从富集到的 24个菌群中共分离得到了81株PAHs降解菌，通过对16S rDNA测序结果进行blast对比，确认筛得的81株菌属于23个属60个种，除两株为厚壁菌门外，其余为变形菌门。菌群Q16有1株菌DAC9的序列与最相近的，可能是潜在的新菌。所有筛得降解菌的系统发育树见图2。系统发育树主要可分为 5簇，其中申氏杆菌属（Shinella）、剑菌属（Ensifer）、双头菌属（Labrys）、鞘脂单胞菌属（Sphingopyxis）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingobium）、短波单胞菌属（Brevundimonas）、固氮螺旋菌属（Azospirillum）、芽孢杆菌属（Bacillus）、螺旋菌属（Spirosoma）、假黄色单胞菌属（Pseudoxanthomonas）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、假单胞菌属（Pseudomonas）为一簇。假黄色单胞菌属DC2单成一簇。伯克氏菌属（Burkholderia）、潘多拉菌属（Pandoraea）、青枯菌属（Ralstonia）为一簇。贪噬菌属（Variovorax）、假食酸菌属（Pseudacidovorax）、食酸菌属（Acidovorax）、嗜脂环物菌属（Alicycliphilus）、Diaphorobacter属为一簇。卡斯特兰尼菌属（Castellaniella）、噬染料杆菌属（Pigmentiphaga）、无色杆菌属（Achromobacter）为一簇。

3 讨论

迄今为止，已有研究报道从不同环境介质中筛选得到多种对PAHs有降解能力的微生物，现已筛选得到70多个属，200多株对PAHs有利用能力的微生物，包括微藻、真菌、细菌等，其中真菌和细菌占多数（Arias et al.，2017）。且很多PAHs降解菌是从红树林沉积物中筛得的，如：福建九龙江河口红树林（骆苑蓉等，2005）、香港米埔红树林（殷波等，2005）、珠海淇澳岛红树林（李玫等，2011）、广州番禺莲花山红树林（李玫等，2012）等，筛得黄杆菌、假单胞菌、弧菌、红球菌、鞘氨醇单胞菌等PAHs降解菌。从大西洋洋中脊表层沉积物中筛得由盐单胞菌属、食烷菌属、海旋菌、Tistrella属组成的PAHs混合物（萘、菲、芘）降解菌群（崔志松等，2009）。从广州石化厂筛得的由假单胞菌属和潘多拉菌属组成的菌群 GP3对芘有较强降解能力（陈晓鹏等，2008）。从油污土壤中筛得由杆菌属、盐单胞属、泛菌属、假单胞菌属菌组成的降解菌群分别对 25 mg·L−1的菲和芘在 15 d时降解75.3%和52.0%，略低于本研究Q15、Q16等菌群（宋立超等，2012）。本研究在海南红树林沉积物中筛得PAHs降解菌种类与上述研究存在一定差异，可能是由于筛选环境、微生物类群、筛选底物、筛选浓度等多种因素的差异共同导致。本研究筛得双头菌属虽王守志等人用混合 PAHs（菲、荧蒽、芘）及 Ma et al.（2010）和 Wang et al.（2012）用混合PAHs（菲、芘、苯并(a)芘）筛选所得菌群中含有双头菌属，但未对其本身降解特性进行研究，而本研究筛得螺旋菌属及卡斯特兰尼氏菌属的细菌对PAHs的降解特性少有报道，其他所得菌属中已有研究的如表3所示。基于传统培养分离得到的菌是菌群中优势菌属（Huang et al.，2008），有研究指出的降解菌有一定的降解偏好（李晓明等，2012），结合表1、表2的结果，菌群Q11仅筛得伯克氏菌3株，Q19仅筛得贪噬菌2株，Q21仅筛得1株鞘脂单胞菌，推测伯克氏菌属、贪噬菌属和鞘脂单胞菌属偏好降解中 3-、4-环 PAHs（菲和芘），说明菌群中优势菌属的降解偏好一定程度上影响了菌群降解能力。菌群Q9仅筛得申氏杆菌2株，其苯并(a)芘降解率最高（49.7%），Q4、Q16对苯并(a)芘降解率接近Q9，这两个菌群中均筛得申氏杆菌，故说明申氏杆菌对于苯并(a)芘的降解可能有重要作用。

图2 所得降解菌进化树Fig. 2 Neighbor-Joining phylogenetic tree of PAHs-degrading bacteria and their closest NCBI (BLAST) relatives based on 16S rRNA gene sequences

芽孢杆菌是已知的能降解苯并(a)芘的菌属之一（Cerniglia，1992），假单胞菌属降解菌多降解低环PAHs，对高环PAHs也有一定降解能力（Chebbi et al.，2017；Zhao et al.，2009），与 MS（鞘氨醇杆菌）相似度达 99%的菌株Sphingobium barthaii可降解菲、荧蒽、苯并[a]蒽等高分子量PAHs（Saraf et al.，2019），结合表3和图2发现降解偏好相似的菌属可聚做一簇。菌群Q1、Q2 3种PHAs降解率相似，Q1筛得假单胞菌 2株，假黄色单胞菌 1株，双头菌1株；Q2筛得假单胞菌3株，假黄色单胞菌1株，假食酸菌1株。Q1、Q2两个菌群筛得菌属相似及筛得的假单胞菌聚为一簇，表明群落结构相似的菌群其降解能力相似，进化距离相近的菌可能具有相近的功能。菌群 Q5、Q18均筛得潘多拉菌，且两个菌群对菲和芘的降解率相近，推测潘多拉菌属偏好于降解菲和芘。仅菌群Q23由假单胞菌属和伯克氏菌属组成，对3种PAHs降解率均低，说明这两个菌属对PAHs的降解可能存在相互抑制的作用。菌群Q7、Q12、Q22均筛得嗜脂环物菌，但Q12对菲、芘的降解率高于其余两个菌群，因此鞘脂单胞菌属和嗜脂环物菌属可能相互促进对菲、芘的降解。基于菌群Q15、Q12的降解结果，推测贪噬菌属和剑菌属共同存在时利于菲的降解，伯克氏菌属与鞘脂单胞菌属共同存在时利于芘的降解。由李晓明等（2012）在 2012年的研究可知降解菌单独存在时一般只适合低分子量PAHs的降解，但在菌群中则可能能降解更多分子量 PAHs，故虽Q5、Q6、Q8、Q11等菌群中没有筛得能直接利用高分子量PAHs的菌属但对苯并(a)芘也有一定利用能力。

表3 已报道的PAHs降解菌属及降解能力Table 3 PAHs degradation strains and the microbial transformation ability

4 结论

在对PAHs的研究中，认为低环的PAHs更易被微生物利用，在本研究中所筛菌群的降解率再次验证此规律。海南红树林沉积物中存在多种 PAHs降解菌，其中双头菌属、螺旋菌属及卡斯特兰尼氏菌属对PAHs的降解特性少有报道，DAC9与最相近的菌株（Spirosoma terrae）相似度仅为97%，可能是潜在的新菌。菌群Q15菲降解率最高达95.3%，菌群Q12芘降解率最高为94%，Q9苯并芘降解率最高为49.7%。贪噬菌属和剑菌属共同存在时可能利于菲的降解，伯克氏菌属与鞘脂单胞菌属共同存在时可能利于芘的降解，鞘脂单胞菌属和嗜脂环物菌属可能能相互促进对菲、芘的降解，潘多拉菌属可能能抑制寡养单胞菌对苯并(a)芘的降解能力，申氏杆菌对于苯并(a)芘的降解可能有重要作用，假单胞菌属和伯克氏菌属可能存在相互抑制作用，这些推测需实验进一步验证。由于传统培养的局限性，菌群中其他可能对PAHs降解有重要作用的菌未分离得到，且菌群中菌间相互作用尚不清楚，仍需进一步研究。