不同分子量黄芪多糖对草酸钙晶体生长的影响及其细胞毒性

陈学武 黄 芳 欧阳健明

(暨南大学生物矿化与结石病防治研究所，广州 510632)

0 引 言

肾结石是世界范围内的常见疾病，且复发率高[1]。草酸钙(CaOx)是肾结石中常见组分，约占70%[2]。一水草酸钙(COM)、二水草酸钙(COD)和三水草酸钙(COT)是CaOx晶体的主要形式。在这3种晶型中，COM的热力学稳定性高，且COM晶体表面带正电荷，与带负电荷的受损伤肾上皮细胞黏附能力最强[3]，致病性也最强；相比之下，表面电荷近中性的COD晶体容易随尿液排出体外[4]；而热稳性较差的COT则在肾结石中较少见。因此将COM转化成COD有利于降低结石形成风险[5]。

研究表明，尿液中大量存在富含羧基(-COOH)和硫酸基(-OSO3H)的葡胺聚糖(GAGs)[6]。这些GAGs不仅可与游离的钙离子结合生成可溶性配合物，降低尿液中CaOx的过饱和度，还能与CaOx晶体的生长位点结合，抑制晶体的生长[7]。植物多糖富含-COOH、-OSO3H等酸性基团，具有与GAGs类似的性质，且细胞毒性小[8-10]，因此，植物多糖有可能用于预防CaOx结石的形成。

植物多糖的生物活性与其分子量大小密切相关[11-12]。Zhao等[13]研究了低分子量的聚古罗糖醛酸硫酸酯(LPGS)对小鼠体内的CaOx晶体生长的调控作用，表明富含羧基的聚阴离子LPGS可以减少小鼠体内晶体的沉积，对小鼠体内的结石有更好的抑制作用。Rajeswari等[14]研究表明，与原始的肝素相比，低分子量肝素具有更高的生物利用自由度，对CaOx晶体介导的氧化应激有抑制作用，可以预防结石形成。除此之外，我们前期的研究还表明多糖的生物活性及CaOx晶体的生长调控还与多糖的浓度有关[15-16]。

黄芪是一种多年生草本植物，广泛存在于温带地区。黄芪多糖(ASP)被视为发挥药理活性的主要成分[17-18]。ASP及从黄芪中提取的皂甙和黄酮均对体外冲击波碎石术引起的肾损伤具有保护作用[19]。ASP对患有肾小球肾炎的大鼠也具有明显的肾脏保护作用[20]。而ASP和大黄酸结合，可以抑制肾小管细胞凋亡，提高肾脏功能，并对灌胃腺嘌呤引起的小鼠慢性肾功能衰竭具有保护作用[21]。基于上述报道，我们预测ASP有可能对肾结石的形成有抑制作用。

1 实验部分

1.1 实验试剂与仪器

草酸钠(Na2Ox)和氯化钙(CaCl2)均为分析纯，实验用水均为二次蒸馏水。Cell Counting Kit-8(CCK-8)细胞增殖毒性检测试剂盒(日本同仁化学研究所)。

原始黄芪多糖(ASP0)由陕西慈缘生物有限公司生产，分子量为11.0 kDa。参照文献[17]通过控制双氧水的浓度和温度得到3种分子量分别为8.4、4.7和2.6 kDa的降解多糖ASP1、ASP2和ASP3(表1)；并采用1H NMR谱、13C NMR谱、红外光谱和气质联用色谱等方法表征了这些多糖的结构，表明降解前后ASP的单糖组成和糖残基连接类型没有明显改变，ASPs都是以(1→4)-D-葡聚糖为主链，(1→6)-D-葡聚糖连接为支链的多糖结构，与文献[20,22-23]报道的一致。

所用仪器有：D/max2400X射线粉末衍射仪(日本理学)，OPTIMA-2000DV电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)(美国PE公司)，XL30型的扫描电子显微镜(荷兰Philips公司)，傅里叶变换红外光谱仪(美国Nicolet公司)，酶标仪(SafireZ，Tecan，瑞士)，倒置荧光显微镜(IX51)(日本奥林巴斯公司)。

表1 0.5 g·L-1不同分子量ASPs诱导的CaOx晶体中COD的含量Table 1 COD content in CaOx crystals induced by 0.5 g·L-1ASPs with different molecular weights

1.2 CaOx晶体的合成及其表征

向各烧杯中加入 40 mL 22 mmol·L-1CaCl2溶液，然后加入一定量不同分子量ASP，并加蒸馏水补充至48 mL，磁力搅拌5 min后，加入40 mL 22 mmol·L-1Na2Ox，使体系终体积为88 mL，此时溶液中Ca2+和Ox2-的浓度为10 mmol·L-1。体系在37 ℃反应10 min后，在恒温条件下静置2 h，离心分离。通过ICP测定上清液中可溶性钙离子浓度，底层CaOx沉淀在真空干燥器中干燥，称重后进行XRD、FT-IR和SEM检测。

X射线衍射(XRD)检测：取上述CaOx沉淀于X射线衍射仪中分析，测试条件为CuKα射线，石墨单色器，工作电压为30 kV，工作电流为25 mA，扫描范围5°～60°，扫描速度8°·min-1，步宽0.02°·s-1，进行定性和定量分析。

在合成的上述CaOx晶体中，二水草酸钙(COD)的相对百分含量根据XRD图采用K值法计算：

上式中ICOD和ICOM分别为COD的主衍射峰(200)晶面(d=0.618 nm)和一水草酸钙(COM)的主衍射峰(101)晶面(d=0.593 nm)的强度。

FT-IR检测：取2 mg已干燥的CaOx样品，与200 mg KBr充分混匀，用玛瑙研钵进行研磨，研磨至看不见金属光泽的粉末，压片，采用红外光谱仪在4 000～400 cm-1范围内扫描。

SEM观察：称取1 mg上述CaOx，分散在10 mL无水乙醇中，在低功率下超声3 min后，点样在10 mm×10 mm的玻片上，于50℃下烘干，样品喷金后用扫描电镜观察晶体的尺寸与形貌，操作条件：电压为5.00 kV，工作距离为5～10 mm，放大倍数为104。

1.3 CaOx晶体的ζ电位测量

参照文献[24]的方法，称取上述在不同条件下得到的CaOx沉淀10 mg，分散在30 mL二次蒸馏水中，悬浮液超声10 min后用ζ电位分析仪测量其ζ电位。

1.4 多糖对HK-2细胞毒性检测

HK-2细胞用含10%(V/V)胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5%(V/V)CO2和饱和湿度下培养。细胞传代采用胰蛋白酶消化法。当细胞达80%～90%汇合后用PBS缓冲液洗涤2次，加入0.25%(w/w)的胰酶-EDTA消化液，置37℃培养箱约3～5 min，在显微镜下观察消化程度，消化适度后，加入含胎牛血清的DMEM培养基终止消化，充分吹打分散细胞，形成单细胞悬液。

将细胞悬浮液(密度为1×105mL-1)接种于96孔板中，每孔0.1 mL，在37 ℃、5%(V/V)的CO2、饱和湿度的培养箱中孵育24 h，使细胞汇合成单层，改用无血清DMEM培养液孵育12 h，弃去培养液，分别加入浓度为20、60和100 μg·mL-1不同分子量的ASP，每孔0.1 mL，每个浓度设3个复孔，同时设细胞对照组(多糖浓度为0)，培养24 h后采用CCK-8法，按照试剂盒测定方法进行操作，置酶标仪，测试450 nm波长处的吸光度(A)，计算细胞存活率，得出多糖对细胞生长的毒性作用。细胞存活率计算公式如下：

1.5 荧光显微镜观察ASPs修复前后HK-2细胞中活性氧(ROS)水平

将细胞分为3组：(1)对照组——加无血清培养基；(2)损伤组——加入2.8 mmol·L-1草酸损伤3 h；(3)修复组——加入2.8 mmol·L-1草酸损伤3 h后再加入 100 μg·mL-1不同分子量 ASPs修复10 h。到达作用时间后，吸除上清液，样品经2′，7′-二氯荧光黄双乙酸盐(DCFH-DA)在37℃染色30 min后，用PBS清洗3次去除未进入细胞内的DCFH-DA，在荧光显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 ASPs浓度调控CaOx晶体生长的XRD分析

根据预实验和文献[15-16]，我们选择在0.05～1.0 g·L-1范围内研究了4种ASPs对CaOx晶体生长的影响。在不同浓度ASPs存在下形成的CaOx晶体的XRD如图1所示。

晶面间距d=0.593、0.364、0.296和0.235 nm处的衍射峰分别归属于COM的和(130)晶面[25]，d=0.617、0.441、0.277和0.224 nm 处的衍射峰分别归属于COD的(200)、(211)、(411)和(213)晶面[26]。图1显示，在ASPs存在下可以诱导COD晶体形成，而且对于同一多糖，在0.05～1.0 g·L-1的范围内，随着多糖浓度的增加，其诱导生成的COD含量逐渐增加(图2)。研究表明过量的Ca2+离子有利于诱导COD晶体的形成，而过量的Ox2-离子则有利于促进COM晶体形成[27]。ASPs分子中的-COOH可以与Ca2+离子配位，多糖分子周围的Ca2+离子浓度快速增加，在局域部分增大了Ca2+与Ox2-的浓度比值；此外，由于多糖表面富集了带正电荷的Ca2+离子，形成一个高能界面，同时被吸附的Ca2+离子自由度降低，能态增加，这种高能界面及高能量环境，均会促进COD的形成[28-29]。因此，在ASPs存在下容易形成COD晶体，而且多糖浓度越高形成的COD越多。

COD晶体与肾细胞膜表面的黏附力远低于COM[30]，相对容易随尿液排出体外，所以，采用ASPs诱导COD晶体形成有利于降低肾结石形成的风险。

图1 不同浓度ASPs存在下CaOx晶体的XRD图Fig.1 XRD patterns of CaOx crystals induced by different concentrations of ASPs

图2 不同分子量ASPs诱导的CaOx晶体中COD含量Fig.2 COD concent in CaOx crystals induced by different concentrations of ASPs with different molecular weights

2.2 不同浓度ASPs调控CaOx晶体生长的FT-IR分析

在FI-IR图中，COM的结晶水在3 058～3 488 cm-1会分裂成多个连续的小吸收峰，在1 618 cm-1处为羰基不对称伸缩振动峰，在1 316 cm-1处为对称伸缩振动峰[31]，而COD的结晶水峰是一个大而宽的单峰，出现在3 452 cm-1。

不同浓度ASP1和ASP3存在下生成的CaOx晶体的FT-IR谱如图3所示。随着ASPs的浓度从0.05 g·L-1增大到1.0 g·L-1，CaOx晶体中不对称伸缩振动νas(COO-)和对称伸缩振动νs(COO-)吸收峰都发生不同程度的蓝移，如在ASP3存在下νas(COO-)从1 616 cm-1增加到 1 642 cm-1(图 4)，νs(COO-)从 1 320 cm-1增加到1 329 cm-1，表明此时生成的CaOx晶体中COM含量在不断下降，而COD含量则逐渐增加，因为COM和COD的νas分别为1 617和1 647 cm-1，νs分别为1 318和1 328 cm-1。可见，FT-IR与XRD的结果基本一致。

在相同浓度范围内，ASP3引起的νas(COO-)和νs(COO-)蓝移程度(26和9 cm-1)较 ASP1(24和6 cm-1)的大，表明分子量小的多糖对CaOx晶体的生长影响更大。

2.3 ASPs分子量差异调控CaOx晶体生长的XRD和FT-IR分析

图5A为4种0.5 g·L-1ASPs诱导生成的CaOx晶体的XRD图。由图可知，4种ASPs均同时诱导生成了COM与COD晶体，但COD的含量差异显著(表1)。分子量越低的多糖，其分子链越短，分子体积越小，粘度越小，水溶性增大，暴露出能与Ca2+配合的有效活性基团(-COOH)比例增加[32-33]，因此，小分子量多糖的螯合Ca2+能力更强，诱导生成的晶体中COD含量更高(表1)。相比之下，没有ASPs存在的空白对照组，只生成COM晶体。

图3 不同浓度ASPs存在下生成的CaOx晶体的FT-IR光谱Fig.3 FT-IR spectra of CaOx crystal after adding different concentrations of ASPs

图4 ASP浓度对CaOx晶体FT-IR谱中主要吸收峰波数的影响Fig.4 Effect of ASP concentration on the main absorption peaks in FT-IR spectra of CaOx crystals

图5 0.5 g·L-1不同分子量多糖调控形成的CaOx晶体的(A)XRD图和(B)FT-IR谱图Fig.5 (A)XRD patterns and(B)FT-IR spectra of CaOx crystals induced by different molecular weights of 0.5 g·L-1ASPs

FT-IR谱(图5B)进一步证明了上述结果。空白组和ASP0诱导的CaOx晶体的νas(COO-)和νs(COO-)分别在1 617和1 318 cm-1左右，表明此时生成的CaOx晶体主要是COM。而0.5 g·L-1ASP1、ASP2和ASP3诱导的CaOx晶体的νas(COO-)分别为1 624、1 637和1 642 cm-1，νs(COO-)分别为1 321、1 325和1 328 cm-1，表明晶体中COD的含量逐渐增加。值得注意的是，由于ASP0诱导的COD含量较低(3.5%)，在FT-IR谱中未能检测出来。

2.4 ASP分子量差异调控CaOx晶体生长的SEM图

SEM图进一步验证了上述结果。不含多糖的空白组生成的晶体均为COM晶体(图6a)，晶体形貌不规则，并存在聚集现象。分子量为2.6 kDa的ASP3调控得到COM与COD混合晶体(图6e)，其中草帽形的COD晶体居多，与XRD定量结果(75.1%(w/w))基本一致。ASP1和ASP2调控所得的晶体(图6(c，d))也是COM与COD共存，但草帽形COD的含量明显少于ASP3组，与XRD检测结果(分别为26.8%和66.0%(w/w))接近。ASP0调控得到的晶体中只出现少许四方形COD晶体(图6b)。

图6 0.5 g·L-1多糖诱导形成的CaOx晶体的SEM图Fig.6 SEM images of CaOx crystals formed in 0.5 g·L-1ASPs

2.5 ASP分子量差异对CaOx晶体ζ电位的影响

图7 不同分子量ASPs对CaOx晶体表面ζ电位的影响Fig.7 ζ potential of CaOx crystals induced by different molecular weights of ASPs

ζ电位可作为粒子间排斥力强度的度量。晶体表面ζ电位绝对值越大，表明晶体表面的电荷密度越大，晶体之间的排斥力也越大，晶体在溶液中的分散性越好，越利于抑制CaOx晶体的聚集。

由图7可知，同一多糖，随着其浓度的增加，ζ电位绝对值也逐渐增大。如ASP1，随着cASP从0.05 g·L-1增大到1.0 g·L-1，诱导生成的晶体的ζ电位绝对值从22.1 mV增大到45.3 mV。

而对于不同分子量的多糖，在同一浓度下，由于分子量越小的ASPs越有利于吸附在晶体表面，从而有效增加了晶体表面的负电荷，导致晶体的ζ电位越负。如在浓度为0.5 g·L-1时，ASPs诱导生成的晶体ζ电位绝对值大小顺序为：ASP3(40.2 mV)＞ASP2(36.5 mV)＞ASP1(32.7 mV)＞ASP0(25.1 mV)。

2.6 不同分子量ASPs对可溶性Ca2+离子浓度和CaOx沉淀量的影响

采用ICP检测在不同浓度ASP1和ASP3的存在下生成CaOx晶体后溶液上清液中可溶性Ca2+离子量(nCa2+)，并检测了CaOx沉淀的量(nCaOx)，结果如图8所示。

ASPs分子中富含-COOH(～16.7%)，可以与 Ca2+配位使体系中Ca2+离子浓度增加(图8)，从而减少CaOx沉淀的质量。此外，富含-COOH的ASPs可以与Ca2+离子形成稳定的配合物链，这种聚合物链可以作为晶体表面上的“栅栏”，抑制晶体的进一步生长[24]。

随着ASPs浓度的增加，上清液中可溶性Ca2+也增加，而诱导生成的CaOx相应减少。如随着ASP3的浓度从0.05增大到1.0 g·L-1，上清液中Ca2+离子的浓度从6.9 μmol·L-1增大到 25.2 μmol·L-1，诱导生成的沉淀量从0.868 9 mmol减少到0.864 1 mmol。

在浓度相同时，多糖的分子量越小，上清液中可溶性Ca2+离子浓度越大，生成的沉淀量越少。

以上结果表明，小分子量多糖与Ca2+配位的能力增强，从而减弱了Ca2+与Ox2-的结合能力，进而抑制了CaOx的生长，抑制了CaOx结石的形成。

图8 不同分子量ASPs诱导下生成的CaOx的物质的量(nCaOx)和溶液中可溶性Ca2+物质的量(nCa2+)Fig.8 Molar amount of CaOx precipitate(nCaOx)and molar amount of soluble Ca2+in the supernatant(nCa2+)induced by different molecular weights of ASPs

2.7 不同分子量ASPs对HK-2的毒性

采用CCK-8法检测了4种ASPs对正常人肾近曲小管上皮细胞(HK-2)的毒性(图9)。HK-2与不同浓度(20、60和100 μg·mL-1)ASPs作用24 h后，细胞活力均仍在100%以上，且随浓度增加，细胞活力增大，这表明在 20～100 μg·mL-1浓度内 ASPs不仅对HK-2细胞不表达毒性，而且还有促进生长的作用。

图9 不同分子量ASPs对HK-2细胞活力的影响Fig.9 Cell toxicity of different molecular weights of ASPs to HK-2 cells

2.8 不同分子量ASPs对损伤HK-2细胞的修复作用

肾上皮细胞损伤是导致尿微晶粘附增加继而诱发肾结石的重要原因之一。而对受损伤的细胞进行修复有可能抑制肾结石的形成[1,8,11]。细胞本身具备丰富的抗氧化防御系统抵抗活性氧(ROS)。但当ROS超过细胞自身的防御能力时就会导致氧化应激，从而介导一系列炎症反应的发生，使得细胞功能受损甚至死亡。这种氧化性的细胞损伤能够促进CaOx晶体在肾脏部位的沉积[34]。

图10为采用DCFH-DA荧光探针检测的各组细胞产生的ROS变化。DCFH本身没有荧光，但可以被细胞内的ROS氧化成有绿色荧光的DCF。检测DCF的荧光强度就可以知道细胞内ROS的水平。由图10可知，损伤细胞产生的ROS分布于整个细胞中，其荧光强度明显高于对照组细胞。而各修复组的ROS出现了不同程度的减弱，且分子量处在中间的ASP2减弱最为明显，即ASP2清除ROS的能力最强。

图10 不同分子量ASPs修复前后HK-2细胞ROS水平的荧光观察图像Fig.10 Fluorescence images of ROS in intracellular for damaged HK-2 cells before and after repairing by ASPs with different molecular weights

2.9 ASP分子量的差异对抑制肾结石形成能力的分析

分子量是影响多糖生物活性的重要因素。一定大小的分子量是多糖具备生物活性的必要条件。对于不同种类的多糖产生最佳生物学活性的相对分子量可能不同。我们的研究结果表明，虽然分子量最小的ASP3抑制CaOx形成、聚集和诱导COD的能力最强，但在修复受损伤的HK-2细胞时却是分子量适中的ASP2(4.7 kDa)最强，分子量过大(11.0和8.4 kDa)或过小(2.6 kDa)均导致其修复能力降低。

ASP2的细胞修复能力最强归因于：当分子量太大时，多糖分子结构紧密，体积很大，水溶性低，迁移到细胞膜的可能性会减小[35]，且难以通过细胞膜障碍发挥其生物作用。而分子量太小的ASP3难以形成能产生活性的聚合结构，导致其生物活性下降。只有适当分子量的多糖，不但具有较大的自由度和较小的空间位阻，需要更少的能量就可以分散到细胞膜的缺口[36]，更易通过静电作用被细胞膜吸收，从而使细胞得到最大修复。因此，将高分子量多糖降解到适当分子量后，其生物活性明显提高。

综上所述，ASP2和ASP3在溶液中的晶体生长实验和细胞实验中表现出不同的活性，这个差异与研究体系的不同有关。细胞实验是活的体系，需要考虑的因素会更多。具体是ASP2还是ASP3的抑制肾结石能力增强，这需要通过动物实验来进一步证实。

3 结论

4种分子量的ASPs均表现出抑制CaOx晶体生长的能力。它们可以增加溶液中可溶性Ca2+离子浓度，减少CaOx沉淀的生成量；抑制COM生长，诱导COD生成；增加晶体表面的ζ电位绝对值，降低晶体的聚集程度。ASPs调控CaOx晶体生长具有明显的浓度效应；在小于1.0 g·L-1时，多糖浓度越高，活性越大。4种ASPs对HK-2细胞不仅没有毒性，还可以修复被草酸氧化损伤的HK-2细胞，降低细胞的ROS水平。ASPs抑制CaOx生长和诱导COD的能力与其分子量呈负相关，即分子量最小的ASP3抑制能力最强；而在修复受损伤的HK-2细胞时，分子量适中的ASP2修复能力最强。综上所述，这些ASPs有可能成为防治CaOx结石的潜在药物，特别是ASP2、ASP3。