马铃薯气生茎腐病菌的室内毒力测定及药剂安全性试验

毕采利，吕文霞，刘广晶，郝向玲，胡 俊

（1.内蒙古农业大学，内蒙古 呼和浩特 010018；2.内蒙古中加农业生物科技有限公司，内蒙古 四子王旗 011800）

我国种植马铃薯已有400 多年的历史。目前，我国马铃薯总产量居世界第一，是世界上最大的马铃薯生产国。马铃薯具有耐干旱、耐瘠薄、高产、稳产的特性，在我国贫困地区的脱贫致富中发挥着重要作用[1]。内蒙古马铃薯的种植面积和产量在全国排名第二，常年播种面积约66.67 万hm2，年鲜薯产量约为1 000 万t，马铃薯是内蒙古自治区的主导农产品[2]。马铃薯气生茎腐病是近年来内蒙古、广西、广东等地新发生的一种细菌性病害，该病菌可侵染种薯、叶柄、茎和块根。连续阴雨天后，马铃薯茎基部会出现褐色至黑褐色软腐；当病症严重时，茎基部先折断后撕裂，易导致植株死亡，一般田块植株发病率为10%～20%，有的超过50%，甚至会导致马铃薯苗大规模死亡，严重影响马铃薯产量和品质。该病害发病程度与马铃薯品种、环境温度、空气湿度、降雨量等因素息息相关。除了采用清洁田园，与非寄主作物轮作等措施预防和控制马铃薯细菌性病害，还要严禁从发病区调运种薯种苗[3-4]。当前，防治马铃薯细菌性病害最有效的方法是化学防治，在药剂防治的报道中主要使用农用硫酸链霉素这一抗生素防治细菌性病害[5-7]。但是，为了减少农业生产中使用医用抗生素可能引起的安全风险，选择安全有效的杀菌剂预防和控制马铃薯细菌性病害显得至关重要。本研究使用滤纸片抑菌圈法对市场上通常用于预防与控制植物细菌性病害的杀菌剂进行室内抑菌毒力测定试验，并进行不同杀菌剂对马铃薯发芽安全性试验，阐明每种药剂对马铃薯气生茎腐病菌的敏感性，找出替代硫酸链霉素的杀菌剂，从而为药剂盆栽试验和大田药剂防治试验提供参考。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试菌株：选用已分离鉴定具有致病性的马铃薯气生茎腐病菌株B-1（Pectobacterium carotovorum subsp.brasilensis）。供试药剂为0.3%四霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸盐。

1.2 试验方法

1.2.1 单药剂毒力测定 抑菌圈法[8-9]：首先将每种供试杀菌剂制备成母液，然后分别稀释成5 个浓度梯度。将直径为5 mm 滤纸片浸入准备好的药液，放置10 min，后用无菌镊子将其取出并进行干燥，备用。待融化的LB 培养基冷却至50 ℃时，将细菌悬浮液（108CFU/mL）倒入LB 培养基，快速且均匀地混合，然后倒入平板制成包含细菌悬浮液的平板。待平板培养基凝固后，将3 片浸泡好药剂的滤纸片放入含菌平板。在28 ℃恒温培养箱内倒置培养48 h后，使用十字交叉法用直尺测量抑菌圈直径，每种处理重复3 次。

通过Excel 软件建立毒力回归方程y=ax+b，将药剂浓度对数值作为自变量，将抑制率几率值作为因变量，以求出各药剂对供试菌的抑制中浓度EC50值和相关系数R2[10-12]。

1.2.2 混配药剂增效测定

1.2.2.1 定性筛选混配药剂的增效作用 采用陈福良等[13]推荐的HorsfaLL 法筛选药剂的最佳配比。从单药剂筛选结果中选取抑制效果最好的药剂进行两两混配，根据将要混配的2种单剂的有效中浓度即EC50值为基础，根据10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7、2∶8、1∶9、0∶10 的体积比配制2种单药剂的有效中浓度药液，然后进行药剂混配毒力测定试验。如果毒性比率＜1 则表明2种混配药剂具有拮抗作用；若毒性比率为1 则表明两种混配药剂具有相加作用；若毒性比率＞1 则表明2种混配药剂具有增效作用。其计算公式为

1.2.2.2 定量筛选混配药剂的增效作用 采用陈福良等[13]推荐的Wadley 法对药剂进行定量筛选。制备单药剂有效浓度梯度分别为500、200、100、50 和25 μg/mL，从混配药剂定性筛选中挑选出最佳混配比例，按照浓度梯度顺序，根据混配药剂增效作用的定性筛选试验选出有增效作用组合的体积比将2种单药剂混合，得到有增效作用的混配药剂浓度梯度，之后进行混配药剂的毒力测定。如果毒力比值＜0.5 则表明2种药剂混配表现出拮抗作用；若毒力比值在0.5～1.5 则表明2种药剂混配具有相加作用；若毒力比值超过1.5 则表明2种药剂混配具有增效作用。其计算公式为

1.2.3 不同杀菌剂对马铃薯发芽安全性试验 选用直径和高均为25 cm 的花盆，并用20 g 左右的马铃薯切块作为种薯，分别用0.3%四霉素261.78 倍液、523.56 倍液和1 047.12 倍液，80%乙蒜素2 842 倍液、5 685 倍液和11 370 倍液，1.8%辛菌胺醋酸盐13 倍液、26 倍液和52 倍液进行薯块拌种，每种药剂倍液分别用20 粒种薯块进行拌种。盆栽所用土壤均进行180 ℃高温灭菌处理5 h，以不加药剂拌种处理为对照（CK），每种处理2 次重复，每次重复10 粒，并在15 d 后取出种薯以观察发芽情况，测量芽长并计算发芽率。

2 结果与分析

2.1 单药剂毒力测定

由表1 可知，80%乙蒜素、0.3%四霉素、1.8%辛菌胺醋酸盐3种杀菌剂对马铃薯气生茎腐病菌有抑制作用，EC50值依次是140.72、5.73 和696.92 μg/mL，相关系数R2由回归方程可得分别为0.965 4、0.956 2和0.939 2。

表1 供试药剂对病原菌的室内毒力测定

2.2 混配药剂增效测定

2.2.1 定性筛选混配药剂的增效作用 从单药剂毒力测定筛选结果中选择抑菌效果最好的3种药剂进行两两混配，即乙蒜素和四霉素，辛菌胺醋酸盐和四霉素，辛菌胺醋酸盐和乙蒜素。由表2 可知，乙蒜素和四霉素的混配组合中毒性比率超过1，具有增效作用的体积比是3∶7、5∶5、6∶4、7∶3；由表3 可知，辛菌胺醋酸盐和四霉素的混配组合中毒性比率超过1，具有增效作用的体积比是6∶4、7∶3、8∶2、9∶1；由表4可知，辛菌胺醋酸盐和乙蒜素混配组合中毒性比率超过1，具有增效作用的体积比是2∶8、4∶6。

2.2.2 定量筛选混配药剂的增效作用 由表5 可知，四霉素∶乙蒜素（7∶3）的抑制效果最好，EC50为0.000 4 μg/mL，相关系数R2为0.955 2；乙蒜素：辛菌胺醋酸盐（6∶4） 的抑制效果较差，EC50为138.239 μg/mL，相关系数R2为0.991 5。测定结果还

表明，四霉素与乙蒜素体积比为5∶5、7∶3、3∶7、4∶6，四霉素与辛菌胺醋酸盐体积比为3∶7、4∶6、1∶9，乙蒜素与辛菌胺醋酸盐体积比为8∶2 时的毒力比值大于1.5，表明2种药剂按以上体积比混配具有增效作用；而乙蒜素与辛菌胺醋酸盐体积比为6∶4 时的毒力比值为0.17，表明2种药剂按以上体积比混配具有拮抗作用；四霉素与辛菌胺醋酸盐体积比为2∶8 时的毒力比值为0.86，表明2种药剂按以上体积比混配具有相加作用。

表2 乙蒜素与四霉素不同配比对病原菌的室内毒力测定 单位∶%

表3 辛菌胺醋酸盐与四霉素不同配比对病原菌的室内毒力测定 单位∶%

表4 辛菌胺醋酸盐与乙蒜素不同配比对病原菌的室内毒力测定 单位∶%

表5 混配药剂对病原菌的室内毒力测定

2.3 不同杀菌剂对马铃薯发芽安全性试验

由表6 可知，80%乙蒜素3 个浓度拌种出芽率40%～85%，1.8%辛菌胺醋酸盐3 个浓度拌种出芽率40%～100%，0.3%四霉素3种浓度拌种发芽率分别为100%、100%和60%，而高浓度四霉素处理过的芽长稍短于CK，结果说明高浓度四霉素、高浓度辛菌胺醋酸盐和高浓度乙蒜素杀菌剂对马铃薯发芽均有一定抑制作用。

表6 不同浓度杀菌剂对马铃薯发芽影响

3 结论与讨论

目前，国内外防治细菌性病害的新型化学药剂种类比较少，以铜制剂为主[14-15]，经滤纸片抑菌圈法毒力测定，对马铃薯气生茎腐病具有直接抑制作用的有四霉素、乙蒜素、辛菌胺醋酸盐3种杀菌剂，辛菌胺醋酸盐是一种广谱性杀菌剂，对一些真菌、细菌及病毒病害有一定的防治效果[16-18]。本研究中0.3%四霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸盐3种杀菌剂对马铃薯气生茎腐病菌有抑制作用，EC50值依次为5.73、140.72、696.92 μg/mL，相关系数R2均大于0.9。对这3种药剂分别进行定性与定量混配药剂增效测定，定性测定结果表明乙蒜素和四霉素混配体积比为3∶7、5∶5、6∶4、7∶3，辛菌胺醋酸盐和四霉素混配体积比为6∶4、7∶3、8∶2、9∶1，辛菌胺醋酸盐和乙蒜素混配体积比为2∶8、4∶6 时，毒性比率大于1，具有增效作用；定量测定结果表明，四霉素与乙蒜素混配体积比为7 ∶3 的抑制效果最好，EC50为0.000 4 μg/mL。在药剂对马铃薯安全性测定中，0.3%四霉素3 个浓度拌种出芽率为100%和100%、60%，高浓度四霉素处理过的芽长稍短于CK，80%乙蒜素3 个浓度拌种出芽率40%～85%，辛菌胺醋酸盐3 个浓度拌种出芽率40%～100%，结果说明高浓度四霉素、高浓度辛菌胺醋酸盐和高浓度乙蒜素杀菌剂对发芽均有一定抑制作用。

因此，在生产中，首选本研究中3种杀菌剂进行防治马铃薯气生茎腐病害，建议在病害预防过程中尽可能根据药剂使用手册中指定的浓度使用该药物，以达到有效预防和治疗病害的目的。